Summary

Trasfezione e Mutagenesi di geni bersaglio in cellule Mosquito da Locked Nucleic Acid modificati Oligonucleotidi

Published: December 26, 2010
doi:

Summary

Oligonucleotidi possono essere utilizzati per il sito specifico sostituire un singolo nucleotide dei geni bersaglio transfettate in entrambe le<em> Anopheles gambiae</em> E<em> Anopheles stephensi</em> Cellule.

Abstract

Parassiti Plasmodium, l'agente eziologico della malaria, sono trasmessi attraverso la puntura di zanzare anofele con conseguente oltre 250 milioni di nuove infezioni ogni anno. Nonostante decenni di ricerca, non esiste ancora un vaccino contro la malaria, evidenziando la necessità di strategie di controllo romanzo. Un approccio innovativo è l'uso di zanzare geneticamente modificati per il controllo dei parassiti in modo efficace la trasmissione della malaria. Alterazioni deliberate delle vie di segnalazione cellulare nella zanzara, tramite mutagenesi mirata, sono stati trovati a regolare parassita sviluppo 1. Da questi studi, possiamo cominciare a identificare gli obiettivi gene potenziale di trasformazione. Mutagenesi mirata è tradizionalmente invocata la ricombinazione omologa tra un gene target e una molecola di DNA di grandi dimensioni. Tuttavia, la costruzione e l'uso di tali molecole di DNA complesse per la generazione di linee cellulari stabilmente trasformate è costoso, richiede tempo e spesso inefficiente. Pertanto, utilizzando una strategia chiuso acido nucleico modificati oligonucleotidi (LNA-ons) fornisce una valida alternativa per l'introduzione artificiale sostituzioni di singoli nucleotidi in obiettivi DNA episomiale e cromosomiche gene (recensione in 2). LNA-ON-mediata mutagenesi previsioni è stato utilizzato per introdurre mutazioni puntiformi nei geni di interesse in cellule in coltura sia di lieviti e topi 3,4. Mostriamo qui che LNA-on può essere utilizzato per introdurre un cambiamento singolo nucleotide in un obiettivo transfettate episomiale che si traduce in un passaggio dal blu proteina fluorescente (BFP) espressione di proteina fluorescente verde (GFP) espressione in entrambe le Anopheles gambiae e Anopheles cellule stephensi . Questa conversione dimostra per la prima volta che la mutagenesi efficace di geni bersaglio in cellule di zanzara può essere mediata da LNA-on e suggerisce che questa tecnica può essere applicabile a mutagenesi di obiettivi cromosomiche in vitro e in vivo.

Protocol

Prima di iniziare il protocollo, è importante stabilire che le cellule zanzara usati nell'esperimento sono sani e alla confluenza ~ 80% se aderente (Figura 1). Cellule ricoperte o insalubri si tradurrà in bassa efficienza di trasfezione e daranno risultati inconsistenti. Scaldare tutti i media prima di utilizzare in un bagno d'acqua ° 28 C per 30 minuti. A. stephensi MSQ43 cellule richiedono E5 medio: MEM, Earle w / glutammina, 5% FCS inattivato con il calore, lo 0,2% di D-glucosio,…

Discussion

Qui vi presentiamo un metodo in vitro e prove per la conversione mirata di un singolo nucleotide in un gene bersaglio episomiale dopo la transfezione di LNA-ons in A. stephensi e A. gambiae cellule. LNA-ON-mediata conversione genica richiede l'induzione di un sito specifico per la risposta di riparazione del DNA, i nostri dati indicano che le cellule di zanzare in grado di supportare questo meccanismo di mutagenesi sito-specifici. Mentre il metodo qui presentato è basato sulla conversione…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Abbie Spinner presso il Centro nazionale di ricerca sui primati della California per la sua assistenza con citometria a flusso. Questo studio è stato sostenuto da un finanziamento dell'Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID) dei National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799 e AI078183.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Effectene transfection reagent   Qiagen 301425  
GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)   Invitrogen K4935-00  
BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO)   Gift from Dr. Concordet3    
LNA-ONs   Gift from Dr. Concordet3    
MEM, Earle’s w/ glutamine   Invitrogen 11095  
Fetal calf serum (FCS)   Invitrogen 16000  
Schneider’s Drosophila medium   Invitrogen 11730  
Non-essential amino acids   Invitrogen 11140  
10% D-glucose   Sigma G5767  
Penicillin-streptomycin antibiotic   Invitrogen 15140  
6-well culture plates   Corning 3516  

References

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Cite This Article
Pakpour, N., Cheung, K. W., Souvannaseng, L., Concordet, J., Luckhart, S. Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (46), e2355, doi:10.3791/2355 (2010).

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