Summary

İntraperitoneal Enfeksiyon sonra Bağışıklık Hücreleri Ticareti Floresan Prion Çubuklar Saat İzlenmesi

Published: November 19, 2010
doi:

Summary

Burada hemen arındırıcı intraperitoneal aşılama ve floresan sonra enjeksiyon yerinde alımı ve hareket izleme ve bu olaylara aracılık eden hücreler karakterize enfekte beyin malzeme toplanan prion çubuklar etiketleme prion alımı ve ticareti bağışıklık hücreleri tarafından izlenmesi için yeni bir tahlil açıklar.

Abstract

Anormal bir formu varlığı, proteaz, dayanıklı, patolojik ve bulaşıcı bir host-kodlanmış prion proteini (PrPC) Kronik Wasting koyun cervids ve scrapie hastalığı (CWD) olarak prion hastalıkları karakterize etmektedir. Prion hipotez bu anormal conformer çoğu veya tüm bulaşıcı prion teşkil ettiğini ileri sürmektedir. Periferik prion patogenezinde erken olaylar bağışıklık sisteminin rolü ikna edici CWD ve scrapie 1-3 kanıtlanmıştır. Farelerde Transgenik ve farmakolojik çalışmalar sonrası erken dönemde enfeksiyon 4-6 prionlar istinat ve kopyalayan Kompleman sisteminin önemli bir rolü ortaya koymuştur. 7-10 dendritik hücreler tarafından prion tutma gözlemledik in vitro ve in vivo çalışmalar, insan ticareti rollerini olmaya devam etmekle beraber, 11-16 belirsiz. Makrofajlar benzer erken prion patogenezinde suçlanmıştır, ancak bu çalışmalar, enfeksiyon 3,11,17 hafta sonra meydana gelen olaylar üzerine odaklanmıştır . Bu ve önceki çalışmalarda da endojen PrP C ve bulaşıcı prionlar arasındaki farklılıklarda sorun muzdarip. İşte biz orada alınan bağışıklık hücreleri tarafından aşılama sitesinden prion alımı ve ticareti değerlendirmek için bir semikantitatif, tarafsız bir yaklaşım açıklar. Toplulaştırılmış prion çubuklar olmayan toplanan proteinleri ve sakaroz yastık üzerinden Ultrasantrifügasyon deterjan çözünürleştirme ile enfekte beyin Homojenat arınmış. Poliakrilamid jel elektroforezi, Coomassie mavi boyama ve zenginleştirilmiş pelet fraksiyonu prion çubuklar batı blotting teyit kurtarma. Prion çubuklar farelere florokrom-etiketli enjekte intraperitoneal. İki saat sonra, peritoneal lavaj sıvısı, dalak ve mediastinal ve mezenterik lenf düğümleri bağışıklık hücreleri prion çubuk tutma ve monositler, nötrofil, dendritik hücreler, makrofajlar ve B ve T hücreleri için işaretleri kullanarak çok renkli akım sitometri ile tespit edilen hücre alt grupları ölçüldü. Bu testte, enfeksiyondan sonra saat içinde bağışıklık elde hücreleri ve in vivo kaçakçılığı prionlar ilk kez doğrudan izleme sağlar . Bu testte de zor ve diğer test sistemlerinde veri yorumlama sorunları neden olabilir normalde ana hücreleri üzerinde ifade PrPC bulaşıcı, toplu prion, açıkça ayırır. Bu protokol, diğer aşılama yolları (oral, intravenöz, intranervous ve derialtı, örneğin) ve aynı zamanda antijenler (konjuge boncuk, viral, bakteriyel ve paraziter patojenler ve proteinler, yumurta) adapte edilebilir.

Protocol

1. Prion Çubuklar Arındırıcı ve Etiketleme Bu protokol daha önce yayınlanmış 18 uyarlanmıştır Ticari bir blender maksimum hızda 1 dakika, 2 dakika sonra buz üzerinde buz gibi homojenleştirici tampon 900 mL prion ile enfekte beyin dokusu 100 gram (HB, 320 mM sakkaroz, 150 mM NaCl ve 4mm EDTA içeren 1X PBS) karıştırılır. Üç kez tekrarlayın. 3000 xg'de 10 dakika ve 4 ° C Homojenat Santrifüj Çıkarın ve buz üzerinde supernata…

Discussion

Burada periferik prion enfeksiyonu erken olayları büyük ölçüde takibini kolaylaştıran in vivo etiketleme ve izleme prionlar için bir protokol göstermektedir . Bu protokol, net bir şekilde endojen PrP C ayırt etmek için, ön-etiketleme zenginleştirilmiş prion inokulum, in vitro 9 ve in vivo 3,12 izleme prion alımını geçmişte girişimleri büyük ölçüde geliştirir. Çünkü bulaşıcı prionlar ve PrP C aynı birincil amino asit dizilimi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Steve McBryant ve Jeff Hansen Biz fare kontrolü ile ilgili yardım için Ultrasantrifügasyon ve Patti Kiser yardım için teşekkür ederim. Ulusal Sağlık Enstitüleri Sinir Hastalıkları ve İnme Ulusal Enstitüsü, hibe 5R01NS056379-02 bu işi finanse edilmektedir.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
CWD-infected elk brain   Private elk farm in Colorado   Use any non-human prion-infected brain
Blender   Oster 6694-015 Use any commercial blender
Centrifuge   Sorvall SS34 rotor Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes
Ultracentrifuge   Beckman 50.2 Ti rotor Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes
Bradford Reagent   Sigma-Aldrich B6916  
Complete mini protease inhibitor cocktail   Roche 11 836 170 001  
Sonicator   Misonix MP4000X Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power
DyLight antibody Labeling kit   Thermo Scientific 53050  
microcentrifuge   Eppendorf 55430R Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g
centrifugal filter columns   Millipore Microcon YM-100 Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff
8-40 week-old FVB mice   Charles River 207 Use any inbred mouse strain
1 μm red fluorescent beads   Phosphorex 2307 Use any fluorescent bead ≤ 10 μm
RPMI 1640 medium   Invitrogen 11875-093  
40 μm cell strainer   Falcon 352340  
fluorescent antibodies   BD pharmingen Various Use any fluorescent antibody appropriate for your application.
flow cytometer   Dakocytomation CyanADP Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection

References

  1. Klein, M. A. A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie. Nature. 390, 687-687 (1997).
  2. Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. Involvement of the immune system in TSE pathogenesis. Immunol Today. 19, 201-201 (1998).
  3. Sigurdson, C. J. PrP(CWD) lymphoid cell targets in early and advanced chronic wasting disease of mule deer. J Gen Virol. 83, 2617-2617 (2002).
  4. Klein, M. A. Complement facilitates early prion pathogenesis. Nat Med. 7, 488-488 (2001).
  5. Mabbott, N. A. Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of C1q significantly delays onset of scrapie. Nat Med. 7, 485-485 (2001).
  6. Zabel, M. D. Stromal Complement Receptor CD21/35 Facilitates Lymphoid Prion Colonization and Pathogenesis. J Immunol. 179, 6144-6144 (2007).
  7. Cordier-Dirikoc, S., Chabry, J. Temporary depletion of CD11c+ dendritic cells delays lymphoinvasion after intraperitonal scrapie infection. J Virol. 82, 8933-8933 (2008).
  8. Dorban, G. Oral scrapie infection modifies the homeostasis of Peyer’s patches’ dendritic cells. Histochem Cell Biol. 128, 243-243 (2007).
  9. Flores-Langarica, A. Scrapie pathogenesis: the role of complement C1q in scrapie agent uptake by conventional dendritic cells. J Immunol. 182, 1305-1305 (2009).
  10. Huang, F. P., MacPherson, G. G. Dendritic cells and oral transmission of prion diseases. Adv Drug Deliv Rev. 56, 901-901 (2004).
  11. Ano, Y., Sakudo, A., Nakayama, H., Onodera, T. Uptake and dynamics of infectious prion protein in the intestine. Protein Pept Lett. 16, 247-247 (2009).
  12. Aucouturier, P. Infected splenic dendritic cells are sufficient for prion transmission to the CNS in mouse scrapie. J Clin Invest. 108, 703-703 (2001).
  13. Huang, F. P. Migrating intestinal dendritic cells transport PrP(Sc) from the gut. J Gen Virol. 83, 267-267 (2002).
  14. Jeffrey, M. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapiesusceptible and scrapie-resistant sheep. J Pathol. 209, 4-4 (2006).
  15. Raymond, C. R., Mabbott, N. A. Assessing the involvement of migratory dendritic cells in the transfer of the scrapie agent from the immune to peripheral nervous systems. J Neuroimmunol. 187, 114-114 (2007).
  16. Mohan, J., Hopkins, J., Mabbott, N. A. Skin-derived dendritic cells acquire and degrade the scrapie agent following in vitro exposure. Immunology. 116, 122-122 (2005).
  17. Gilch, S. CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells. FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).
  18. Safar, J. Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).
  19. Büeler, H. R. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73, 1339-1339 (1993).

Play Video

Cite This Article
Johnson, T. E., Michel, B. A., Meyerett, C., Duffy, A., Avery, A., Dow, S., Zabel, M. D. Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection. J. Vis. Exp. (45), e2349, doi:10.3791/2349 (2010).

View Video