Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

1. Подготовка Ретровирусные Построить Sub-клон Т-клеточный рецептор (TCR) гена в ретровирусные вектора (рис. 1, например векторы PMSG 7, pMIGII 5,8, pMXs от Cellbiolabs). TCR α и β ген цепи должны быть на тот же вектор под контролем того же промотора для обеспечения равного выражения. Если TCR интересов человека, человека константные домены должны быть заменены с помощью мыши константных доменов 9. Наши наблюдения является то, что всю длину человеческой ТКО не стабильно выразить на мышь Т-клеток. Подготовка высококачественных плазмидой ДНК с использованием Qiagen Maxi Prep Kit или аналогичный продукт. Концентрация плазмиды должна быть на уровне около 1 мкг / мкл. 2. Трансфекция и Т-клеточного Изоляция День 1 (клетки пластины упаковка) Выбить Платиновый-E (Плат-E, Cellbiolabs) ретровирусных клетки упаковки с помощью трипсина-EDTA и нейтрализовать с DMEM СМИ. Центрифуга клетки при 1000 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в DMEM СМИ. Определить номер ячейки и разбавленных клеток 0.6×10 6 / мл. Пластина 10 мл клеточной суспензии в 10 мм поли-лизин покрытием планшета для культуры ткани и расти ночь в камере инкубатора при 37 ° C, 5% СО 2. День 0 (трансфекции) Следующим утром, исследовать клетки под световым микроскопом. Камеры должны быть примерно на 80% вырожденная. Аккуратно снимите СМИ от пластины. Вымойте клетки сразу с 1x PBS и добавьте 10 мл подогретого, свежие DMEM СМИ без Пенициллин-Стрептомицин (Pen / Strep). (Примечание: Ручка / Strep может помешать трансфекции) Подготовка трансфекции комплекса. Подготовка смеси А и В следующим образом: Mix: ДНК плазмиды 9 мкг PCL-Эко помощник плазмиды 6,3 мкг OptiMEM 1,5 мл Mix B: Lipopfectime 2000 60 мкл OptiMEM 1,5 мл Инкубируйте и Б отдельно в течение 5 минут при комнатной температуре Смешать и В вместе мягко и инкубировать 20 минут при комнатной температуре до трансфекции комплекса. Медленно капельного смеси (всего 3 мл) в Плат-E клеток. Осторожно пластину вперед и назад, чтобы распространять трансфекции смесь равномерно. Инкубируйте клетки при 37 ° C / 5% СО 2 в камере инкубатора. Через 6-8 часа заменить среду с 10 мл свежей среды DMEM (с ручкой / Strep) для вирусного производства. Пальто пластины с антителами Мышь Т-клетки должны быть активирована до вирусной трансдукции. Существуют различные способы активации Т-клеток. Здесь мы используем пластины связаны анти-CD3e и анти-CD28 антител. Подготовка антител смесь из 1 мкг / мл анти-CD3e и 2 мкг / мл анти-CD28 в стерильном PBS. Внесите 250 мкл антител смеси в каждую лунку 24-луночного планшета для культуры ткани. Пластины могут быть покрыты в течение ночи при 4 ° С или 2 часа при температуре 37 ° C. Подготовка одного суспензии клеток селезенки от мышей Урожай селезенки мышей и трансфер в среде RPMI. Место селезенки в камере фильтра. Маш селезенки поршень шприца на 5 см пластина культуры ткани. Промойте клетки от ячейки фильтра стерильной PBS. Центрифуга 1000 мкг, 5 мин. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в буфере ACK лизирующего (2 мл на селезенки). Инкубируйте от 2 до 3 минут при комнатной температуре. Добавить RPMI среде до 20 мл и 1000 мкг центрифуги в течение 5 мин. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в стерильных PBS. Определение количества клеток и центрифуги 1000 мкг в течение 5 мин при 4 ° C. Приступить к изоляции Т-клеток. Выделение и активация мышью Т-клеток Магнитное этикетке клеток в соответствии с руководством по продукции (CD8 + Т-клеток изоляции комплект от Miltenyi Biotec). Место LS колонке (Miltenyi Biotec) в мagnetic области. Применение меченых клеточную суспензию в колонку. Сбор проточные (обогащенный мыши CD8 + T-клеток). Промыть колонку в три раза с 3 мл буфера в соответствии с руководством по продукции и комбинировать с предыдущими проточные. Пятно клетки с анти-CD3e и анти-CD8a антител и анализировать с помощью проточной цитометрии (рис. 2а). Для типичного разделения, ~ 8-10% от общего числа клеток может быть изолирован. ~ 90% от изолированной клетки CD8 + Т-клеток. Центрифуга клетки при 1000 мкг, 5 мин. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в среде RPMI с рекомбинантным человеческим IL-2 (rhIL2, 20 нг / мл) при 1х10 6 / мл. Просто, прежде чем добавить соты, удалить раствор антител от пластины (подготовленные ранее в 2.11). Промыть каждую лунку стерильной PBS и удалить PBS. Добавить 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку. Положите пластины при температуре 37 ° C / 5% СО 2 в камере инкубатора. 3. (2-й день и День 3) Заражение активированных Т-клеток Через 2 дня вируса производства, среды, в Плат-E ячейки пластины должны стать желтым. Передача вирусного супернатанта в 15 мл коническую трубку. Добавьте 10 мл свежей среды DMEM к пластине для дальнейших вирусных производства (опционально). Центрифуга вирус супернатант при 1000 мкг в течение 5 минут, чтобы удалить клетки мусора. Тщательно передачи вируса супернатант в новую пробирку. Оставьте немного жидкости на дне пробирки и не беспокоить клетки мусора. Сбор активированных Т-клеток с пластинки в 50 мл коническую трубку. Определить число клеток. Сохранить некоторые клетки в отдельную трубку для использования в качестве отрицательного (ООН-трансдуцированных) контроля. Центрифуга при 1000 мкг в течение 5 мин и отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в вирус супернатант на 10 6 клеток в 1 мл с 20 нг / мл rhIL2 и 10 мкг / мл протамина сульфата. Добавить 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку 24-луночный планшет. Ресуспендируют клеток в контрольную пробирку в среде RPMI при одинаковой плотности ячейки с таким же количеством rhIL2 и протамина сульфата. Добавить клетки той же пластинке. Оберните пластину с пластиковой пленкой. Центрифуга 90 минут при 2000 мкг, при 32 ° C, без тормозов. После центрифугирования, удалить пленки. Добавьте 1 мл свежей среды RPMI с 20 нг / мл rhIL2 в каждую лунку. Положите пластину обратно в инкубатор. (Дополнительно) высшего уровня экспрессии TCR может быть достигнуто путем сбора вируса супернатант и повторяющиеся инфекции процедуры в день 3. 4. Расширение клетки и оценка эффективности трансдукции Изучить трансдуцированных Т-клеток в день. Разделение клеток в соотношении 1:03, когда это необходимо в RPMI среду rhIL2. Не позволяйте клетки разрастаются (средний желтеет). В день, 6 или 7 дней, пятно клеток с антителами и МНС тетрамер специфичные для ТКС для вычисления выражения ТКР на Т-клеточной поверхности. Использование не-трансдуцированных Т-клеток в качестве контрольных (рис. 2). Трансдуцированных Т-клетки готовы к дальнейшему течению приложений. 5. Представитель Результаты Очень часто выгоднее, чтобы очистить Т-клеточных подмножеств до трансдукции хотя спленоцитов можно трансдуцированных без очистки. Высокая чистота Т-клеточных подмножеств может быть получена с использованием коммерческих магнитных шариков (рис. 2а). Для оценки уровня экспрессии ТКО на Т-клетки, антитела, специфичные для TCR альфа-или бета-цепи могут быть использованы. Обычно 30% до 80% клеток может выразить трансдуцированных TCR (рис. 2, б) в зависимости от генов TCR и вирусные титры. MHC тетрамер специфичные для TCR также может быть использована для дальнейшего проверить функциональное выражение ТКО (рис. 2в). Рисунок 1. Пример Т-клеточный рецептор гена построить к югу от клонировали в ретровирусного вектора. Полная длина альфа-и бета-гены цепочки связаны между собой самостоятельно расщепляемого 2А пептидный линкер 8. Рисунок 2. Пример успешного изоляции и трансдукции мыши Т-клеток. () CD8 T-клетки были выделены из спленоцитов использованием CD8a + Т-клеток изоляции Kit (Miltenyi Biotec) и окрашивали анти-CD3e и анти-CD8a антител. Изолированные CD8 T-клетки трансдуцированных с R6C12 TCR специфичны для человека gp100: 209 -217 4 пептида и окрашивали анти-человеческий Vbeta 8 антител (б) и HLA-A2kb gp100 тетрамер (с).