아쿼틱 시스템에서 바이러스 생산 요금 예측

1. "바이러스 무료"물 (빌헬름 & Poorvin 2001)를 생성하기 위해 해수의 Ultrafiltration 해수 / lakewater 약 20L가 가능한 무균 수집됩니다. 워터는 순차적으로 142 – mm 직경의 폴리 카보 네이트를 통해 지역 사회의 분석을 위해 -20 ° C에서 보관 수있는 0.8 μm의 필터를 prefiltered입니다. 큰 기공 크기 필터는 매우 생산적인 시스템에 대해이 단계 이전에 사용할 수 있습니다. 30 KDA – 커토프 나선형 카트리지가 모두 바이러스를 제외하는 데 사용됩니다 Amicon M12 시스템 (Millipore), 심지어는 작은 RNA 바이러스의 ultrafiltered 물을 얻을 수 있습니다. 샘플은 backpressure의 ~ 15-16 kPa로 처리 ~ 25 %의 속도로 집중되고있다. 물 ~ 500 ML의 나머지 샘플은 바이러스 무료 물의 나머지 19.5 L가 바이러스성 생산 assays에 사용됩니다 동안 집중 바이러스 커뮤니티 (어떤 다른 실험을 위해 저장될 수도 있습니다)가 포함됩니다. 이용의 각 하루를 보낸 후, Amicon M12 시스템은 필터 카트리지의 멤브레인 손상을 방지하기 위해 청소해야합니다. 이 해수와 함께 작업하는 경우 30~45분에 대한 0.1N NaOH 용액과 함께 세탁 다음 밀리 Q 물 최소한 6L와 멤브레인을 씻어. 다시 밀리 Q 물 최소한 6L와 카트리지를 씻어. M12 시스템을 이용하여 작업이 완료되면 나선형 카트리지 4 0.05MH 3 PO 4 용액 ° C.에 보관해야 2. 바이러스성 생산을위한 바이러스 감소 방법 (빌헬름 외. 2002) 최대 두 호스트 및 바이러스가 0.2 – μm의 공칭 기공 크기 낮은 단백질 바인딩 그것에 배치 필터 (예 : Durapore.) 함께 취득하고 sterifilter 단위에 배치됩니다와 해수 / lakewater 샘플 500 ML에 지속 필터에 집중에서 박테리아 세포를 억제하는 살균 전송 피펫을 사용하여 샘​​플 resuspending하면서 예제는 부드럽게 <200 mmHg로 압력을 진공이다. 천천히 ultrafiltrate 세 볼륨 크게 샘플 무료 바이러스의 수를 줄이기 위해 세균 현탁액에 추가됩니다. 세균성 분수는 바이러스가없는 물 500 ML로 희석 세 나누어 150 ML 각 복제 맑은 250ml 폴리 카보 네이트 병에 배치됩니다있다. 3. 바이러스성 생산을위한 접선 흐름 여과 (TFF) 방법 (Weinbauer 외. 2002 윙젯 외. 2005) TFF는 바이러스 감소 방법에 대한 대안적인 접근 방식을 나타냅니다. 위에서 설명한대로 자연 시료의 약 500 ML이 수집됩니다. 이 예제는 0.2 – μm의 공칭 기공 크기의 접선 흐름 여과 시스템을 사용 집중되어 있습니다. 세균성 분율이 약 10-15 ML로 감소되면, ultrafiltered, 바이러스 무료 물을 추가하고 위와 같이 배포됩니다. 복제 병은 환경 챔버를 사용하여 현장 조건에 incubated 수 있습니다. 라이트 수준은 빛의 강도를 감소 NET 심사와 푸른 적용된 아크릴 또는 취소 아크릴을 사용하여 표면 조건 변경됩니다. 주위 표면 온도는 종종 흐르는 해수 데크 배양기를 사용하여 얻을 수 있습니다. 박테리아와 바이러스성 풍부한 견적에 대한 샘플은 cryovials에 추가 2.0-2.5 % 살균 글루 타 알데히드의 최종 농도와 시간을 0에서 찍은 있습니다. 이 샘플은 즉시 액체 질소로 냉동 플래시하고 처리하기 전까지 냉동 저장됩니다. 액체 질소를 사용할 수없는 경우, 현미경 슬라이드는 (아래 절차를 참조) 준비하고 즉시 처리할 수 있습니다 Subsamples은 위에서 설명한 방법으로 적어도 10 시간 동안 매 2.5 시간을 수집하고 있습니다. 이 시간에 물을 정량 PCR 분석을 위해 수집될 수 있습니다. 최대 샘플 5 ML하기는 액화 질소에 즉시 플래시 냉동로없이 정착액 에이전트 cryovial에 추가할 수 있습니다. 4. 바이러스성 생산 현미경 (노블 & 퍼먼 1998, 웬 외. 2004) 0.02 – μm의 현미경에 대한 필터링하는 냉동 샘플은 얼음에서 해동해야합니다. 멸균 물 주식 솔루션 1시 10분을 diluting하여 SYBR 녹색의 주식 솔루션을 준비합니다. 다음 주식 솔루션에서 멸균 물 39 ML에 대한 재고 솔루션의 1mL를 추가하여 작업 솔루션을 준비합니다. 50 % 글리세롤, 50 % 인산이 호수 솔루션을 버퍼 (PBS, 0.05 M 나 2 HPO 4, 0.85 % NaCl, 산도 7.5) 및 P – phenylenediamine의 신선한 2.5 % 주식 솔루션은 또한 시작하기 전에 준비를해야합니다. 4 50 % glycerol/50 % PBS 솔루션을 유지 ° C 및 P – phenylenediam-20에서 오프라인 재고 ° 시작 때까지 어둠 속에 C. 오른쪽 필터링하기 전에 Antifade 솔루션으로 사용되는 0.1 %의 최종 농도 50 % glycerol/50 % PBS로 P – phenylenediamine를 추가합니다. 0.45 – μm의 MicronStep, cellulosic 후원 필터의 상단에 0.02 – μm의 Anodisc 필터 25mm를 놓습니다. 완전히 건조까지 20 pKa에 Anodisc과 진공의 상단에 고정 샘플 850 μL를 추가합니다. 플레이스 100 멸균 페트리 접시에 SYBR 그린 작업 솔루션의 μL, 그리고 여전히 진공으로 조심스럽게 SYBR 그린 필터 탑과 장소에서 Anodisc를 제거합니다. 20 분 상온에서 어둠의 샘플을 품어. 조심스럽게 SYBR 그린 솔루션에서 필터를 제거하고 모든 잔류 염료를 제거하는 Kimwipe와 필터의 뒷면 윅. 원하는 경우, 타워에 필터를 반환하고 여분의 얼룩을 씻어하는 필터를 통해 0.02 – μm의 여과 물 또는 멸균 미디어 800 μL까지 전달합니다. 현미경 슬라이드에 antifade 솔루션의 작은 방울을 추가하고 위에 덮개 용지를 넣으십시오. 커버 슬립을 제거하고 antifade 솔루션와 젖은 현미경 슬라이드에 말린 필터를 추가합니다. 다시 커버 슬립에 antifade 솔루션의 작은 금액을 추가하고 천천히 그 양식을 수있는 모든 거품을 제거해야하고, 필터의 상단에 배치하십시오. 필요가 (이가 변색 방지하기 위해 몇 개월 이내에 사용되며, 바이러스 카운트를 낮춘한다)까지 즉시 -20 ° C에서 슬라이드를 동결 바이러스는 다양한 파란색 필터 세트 (λ 예 = 450-490 nm의, λ λ 엠에서 억제 필터 = 510 NM = 510 nm의)와 (과 우리의 경우 Leica DMRXA 현미경) 형광 현미경을 사용하여 열거됩니다. 각 필터는 필터 멤브레인 전체 바이러스의 균등을 보장하기 위해 각 분야의 그리드에서 전체 바이러스를 계량해야하고, 계산보기 최소한 20 필드를합니다. 세 독립에서 바이러스 reoccurrence의 평균 가격은 다음 계산하고 표준 편차가 생산 가격에서 결정됩니다 복제합니다. 5. 대표 결과 연구자에 의해 수집된 원시 데이터는 바이러스 풍요의 reoccurrence 속도를 생성하기 위해 최소한의 수학적 처리를 필요로합니다. 본 연구의 결과 기본 데이터 집합은 incubations에서 subsamples에서 바이러스 풍요의 reoccurrence 요금입니다. 이러한 결과는 샘플의 각 바이러스 어번던스 대 시간의 독립 regressions를 형성하고 있습니다. 각 샘플에 대해 개별 incubations이 연구원은 가격뿐만 아니라 변화의 추정 (예 : 표준 편차) (그림 1 참조). 계산할 수있는 세 가지 복제 – incubations을 작성하여 이렇게 하나의 치료 역할 이 과정 중 하나 주의해야 할 점은 바이러스 어번던스 불변의 감소는 바이러스 부담을지고있는 예제에서 호스트 세포의 감소로 연결한다는 것입니다. 소스 (필터없는 해수 또는 호수)와 T = 0 배양 샘플 모두에서 손실, 세균성 풍요의 열거를 상쇄하기 위해서 필요합니다. 이 정보가 손실 세포의 비율을 위해 계정을 사용할 수 있습니다 바이러스 풍부한를 줄이는 과정이 또는 미생물 지역 사회의 모든 구성원에 대한 선택이 아니라고 가정하면,이 요소는 다음 바이러스의 현장 생산 가격 추정하는 데 사용할 수 있습니다 . 그림 1. epifluorescence 현미경을 사용하여 현장 조건에서 10 시간 보육을 통해 입자와 같은 바이러스. 샘플의 생산은 2008 년 9 월 뉴질랜드의 해안에서 피는 식물성 플랑크톤을 통해 수집된되었습니다. 그림 2. 바이러스 생산을 시금위한 워크플로우 프로세스의 개략도 그림.이 과정은 바이러스 무료 물을 생성하는 샘플 물 ultrafiltration 시작합니다. 이 ultrafiltration 시스템을 사용하여 완료됩니다. 미생물 커뮤니티 (감염되지 않은 감염된 세포의 혼합물을 포함) 유지하는 동안 병렬 물 샘플에서는 필터를 통해 전달되는 동일한 사이트 및 무료 바이러스로부터 수집하고 있습니다. 이 커뮤니티는 다음 바이러스 무료로 물에 resuspended 및 현장 조건에 따라 incubated입니다. 바이러스의 reoccurrence 요금은 다음 바이러스 생산 속도를 결정하기 위해 앞으로 10 시간 동안 감시하고 있습니다.