Su Sistemleri Virüs Üretim Oranlar tahmin

1. "Virüs-free" Su (Wilhelm & Poorvin 2001) oluşturun için Deniz Suyu Ultrafiltrasyon Deniz suyu / lakewater yaklaşık 20L mümkün olduğunca aseptik toplanır. Su, 142 mm çaplı polikarbonat seri ile toplum analizi için -20 ° C'de muhafaza edilebilir 0,8 mikron filtre prefiltered. Daha büyük gözenek boyutu filtreleri, çok verimli sistemler için bu adımı önce kullanılıyor olabilir. 30 kDa kesme spiral kartuşu tüm virüsleri dışlamak için kullanılan bir Amicon M12 sistemi (Millipore), hatta küçük RNA virüsleri Ultra filtre su elde etmek için. Yaklaşık 15-16 kPa backpressure örnekleri ile işlenmiş ve ~% 25 hızda yoğunlaşmıştır. ~ 500 ml su kalan örnek virüs serbest su, geri kalan 19.5 L viral üretim deneyleri için kullanılan olacak konsantre bir virüs topluluk (diğer deneyler için kaydedilebilir) içerecektir. Amicon M12 sistemi kullanımı her gün sonra, membran filtre kartuşunun zarar görmesini önlemek için temizlenmesi gerekir. Deniz suyu ile çalışıyorsanız, 30-45 dakika için 0,1 N NaOH çözeltisi ile yıkanması takip Milli-Q su en az 6L membran yıkayın. Yine kartuşu en az 6L Milli-Q su ile durulayın. M12 sistemini kullanarak bittiğinde, spiral kartuşu, 4 0.05MH 3 PO 4 çözüm ° C saklanmalıdır 2. Viral Üretim Yöntemi Virüs Azaltma (Wilhelm ve ark 2002) Hem de ev sahibi ve virüsler, 0.2 mikron nominal gözenek boyutu düşük protein bağlayıcı filtresi (örneğin, Durapore) üzerine yerleştirilir. Ile elde edilen ve bir sterifilter ünitede yerleştirilir deniz suyu / lakewater örnek 500 ml Sürekli olarak, filtre üzerinde yoğunlaşarak bakteri hücrelerinin inhibe etmek için, steril bir transfer pipet kullanarak örnek resuspending örnek hafifçe <200 mmHg basınçlı vakum. Yavaş yavaş ultrafiltratında üç ciltlik önemli ölçüde örnek ücretsiz virüs sayısını azaltmak için bakteriyel süspansiyona eklenir. Bakteriyel fraksiyonu virüs ücretsiz su ile 500 mL geri seyreltilir ve her biri 150 ml olmak üzere üçe ayrılır çoğaltır ve açık 250ml polikarbonat şişe konur. 3. Viral Üretimi için Teğetsel Akış Filtrasyon (TFF) Yöntemi (Weinbauer ve ark 2002, Winget ve ark 2005) TFF viral azaltma yöntemine alternatif bir yaklaşımı temsil ediyor. Yukarıda açıklandığı gibi, yaklaşık 500 ml doğal örnek toplanır. Bu örnek, gözenek boyutu 0.2 mikron nominal teğetsel akış filtrasyon sistemi kullanarak yoğunlaşmıştır. Yaklaşık 10-15 ml bakteri fraksiyon azalır, Ultra filtre, virüs serbest su eklenir ve yukarıdaki gibi dağıtılır. Çoğaltmak şişe çevre odaları kullanılarak yerinde koşullarda inkübe edilir. Işık seviyeleri net tarama ile mavi renkli akrilik veya şeffaf akrilik kullanarak ışık yoğunluğunu azaltmak için yüzey koşulları değişmiş. Ortam yüzey sıcaklıkları genellikle akan deniz suyu güverte inkübatör ile elde edilir. Cryovials ilave% 2,0-2,5 steril glutaraldehid son bir konsantrasyon ile 0 zamanında bakteriyel ve viral bolluk tahminleri için numuneler alınır. Bu örnekler hemen sıvı nitrojen ile dondurulur flaş ve işlenmiş kadar dondurularak saklanmalıdır. Sıvı azot mevcut değilse, mikroskopi slaytlar (aşağıdaki yordama bakın) hazırlanan ve hemen işleme olabilir Alınan örnekler, yukarıda anlatılan yöntemi ile en az 10 saat boyunca her 2.5 saatte toplanır. Bu zaman su kantitatif PCR analizi için toplanan olabilir. 5 ml numune sıvı nitrojen içinde acil flaş dondurma hiçbir sabitleştirici ajan cryovial eklenebilir. 4. Viral Üretim Mikroskobu (Noble ve Fuhrman 1998 Wen ve ark 2004) 0.02-mikron mikroskopi için filtre uygulanmasını Donmuş numuneler buz üzerinde çözdürülmelidir. SYBR Green, steril su ile stok solüsyonu 01:10 seyreltilmesi ile bir stok solüsyonu hazırlayın. Sonra, stok solüsyonu, stok solüsyonu 1 ml, 39 ml steril su ekleyerek çalışan bir solüsyon hazırlanır. % 50 gliserol,% 50 fosfat serum fizyolojik tamponlu (PBS, 0.05 M Na 2 HPO 4,% 0.85 NaCl, pH 7.5) ve% 2.5 p-fenilendiamin taze stok solüsyonu başlamadan önce hazırlanmalıdır. 4% 50% glycerol/50 PBS çözüm tutun ° C ve P-phenylenediamine stok -20 ° C başlangıç ​​kadar karanlıkta. Sağ filtreleme önce Antifade çözüm olarak kullanılmak üzere bir final konsantrasyon% 0.1% 50% glycerol/50 PBS p-fenilendiamin ekleyin. 25 mm 0.45 mikron MicronStep, selülozik destek filtre üst 0.02 mikron Anodisc filtre koyun. Tamamen kurutulmuş kadar 20 pKa Anodisc ve vakum üst sabit numune 850 mcL ekleyin. 100 steril bir Petri kabı SYBR Green çalışma çözüm mcL ve hala vakum, SYBR Green filtre kulesi ve yerden dikkatlice Anodisc kaldırmak. Örnekleri 20 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin. Dikkatle SYBR Green çözüm filtreyi kaldırmak ve tüm kalan boya kaldırmak için bir filtre ile Kimwipe arka fitil. İsterseniz, kule filtre dönmek ve aşırı leke durulayın filtre ile 0.02 mikron süzülmüş su veya steril ortam 800 mcL kadar geçmek. Bir mikroskop lamı antifade çözüm küçük bir damla ekleyin ve üstüne bir kapak kayma yerleştirin. Kapak kayma çıkarın ve mikroskop lamı antifade çözüm ıslak kuru filtre ekleyin. Yine kapak kayma antifade çözüm küçük bir miktar ekleyin ve yavaş yavaş bu formun herhangi bir kabarcıkları kurtulmak için emin olun, filtrenin üstüne yerleştirin. Gereken (bu solmaya önlemek için bir kaç ay içinde kullanılır ve virüs sayıları indirdi olmalıdır) kadar -20 ° C'de hemen slaytlar dondurmak Virüsler, geniş bir mavi filtre seti (λ Ex = 450 – 490 nm, λ Em = λ bir bastırma filtresi 510 nm = 510 nm) ile (bizim durumumuzda bir Leica DMRXA mikroskop) floresan mikroskopi kullanılarak numaralandırılır. Her filtre, filtre zarından virüs bile dağılımını sağlamak için her alanda ızgara toplam virüsleri ölçmek için emin olun, en az 20 alan sayılır görünümü olacak. Üç bağımsız virüs tekrarını ortalama oranları hesaplanır ve standart sapma üretim oranları belirlenir çoğaltır. 5. Temsilcisi Sonuçlar Araştırmacı tarafından toplanan ham veri virüs bolluk tekrarını oranları üretmek için minimal matematiksel işleme gerektirir. Bu çalışmada kaynaklanan birincil veri seti inkubasyon alınan örnekler virüs bolluk tekrarını oranları. Bu sonuçlar, örneklerin her biri için virüs bolluğu vs zaman bağımsız regresyonlar oluşturur. Her bir numune için ayrı ayrı inkubasyon araştırmacı oranlarının yanı sıra bir varyasyon tahmini (örneğin, standart sapma) (bkz. Şekil 1). Hesaplayabilirsiniz üç çoğaltmak-inkubasyon tamamlayarak, bu yüzden bir tedavi olarak hareket Bu sürecin bir ihtar virüs bolluk değişmez bir azalma örnek virüs yükünü taşıyan ana hücrelerinde azalmaya yol açar. Kaynak (filtrelenmemiş deniz suyu veya göl suyu) ve T = 0 inkübasyon örnek, bakteri bolluk sayımı bu kayıp telafi etmek gereklidir. Bu bilgiler, kayıp hücrelerinin yüzdesini hesap kullanılır: virüs bolluk azaltma süreci için ya da herhangi bir mikrobiyal topluluğun üyelerine karşı seçici olduğunu varsayarak, bu faktör daha sonra virüs yerinde üretim hızı tahmin etmek için kullanılır. . Şekil 1. Epifloresans mikroskopi kullanılarak in situ koşullarda 10 saat inkübasyon üzerinde parçacıklar gibi virüs Örnekleri üretimi 2008 yılı Eylül ayında Yeni Zelanda'nın kıyılarında çiçek fitoplankton sırasında toplanmıştır. Şekil 2. Assaying virüs üretim için iş akış sürecinin şematik diyagramı. Virüssüz su üretmek için numune su ultrafiltrasyon süreci başlar. Bu bir ultrafiltrasyon sistemi kullanılarak tamamlandı. Paralel su örneklerinde mikrobiyal topluluğun (enfekte ve enfekte olmayan hücrelere bir karışımını içeren) muhafaza ederken, bir filtre ile geçti aynı sitede ve serbest virüslerle toplanır. Bu topluluk daha sonra virüs ücretsiz su ile yeniden süspanse ve yerinde koşulları altında inkübe edilir . Virüs tekrarını oranı, önümüzdeki 10 saat sonra virüs üretim oranlarını belirlemek için izlenmektedir.