הערכת הפקה חליפין וירוס במערכות Aquatic

1. Ultrafiltration של מי ים כדי לייצר "וירוס חינם" מים (וילהלם & Poorvin 2001) כ 20L של מי ים / lakewater נאסף כמו בסביבה נקייה מחיידקים ככל האפשר. מים prefiltered סדרתי דרך 142 מ"מ קוטר פוליקרבונט 0.8 מיקרומטר מסננים כי אפשר לשמור על -20 ° C לניתוח הקהילה. מוגדלת גודל מסננים נקבוביות ניתן להשתמש לפני שלב זה עבור מערכות פורה מאוד. כדי להשיג מים ultrafiltered ממערכת Amicon M12 (Millipore) 30 kDa-הפסקת המחסנית ספירלה משמש לכלול את כל וירוסים, אפילו קטן וירוסים RNA. הדגימות מעובדים מרוכז במהירות ~ 25% עם 15-16 kPa ~ של backpressure. המדגם הנותרים של 500 מ"ל מים ~ יכיל הקהילה נגיף מרוכז (אשר ניתן לשמור על ניסויים אחרים), בעוד הנותרים 19.5 ליטר של מים מווירוסים ישמש מבחני ההפקה ויראלי. אחרי יום אחד של שימוש, המערכת M12 Amicon יש לנקות כדי למנוע נזק הממברנה של מחסנית המסנן. אם אתה עובד עם מי ים, יש לשטוף את הממברנה עם לפחות 6L מים מילי-Q ואחריו כביסה עם פתרון NaOH 0.1N עבור 30-45 דקות. שוב לשטוף את המחסנית עם לפחות 6L מים מילי-Q. בסיום השימוש במערכת M12, מחסנית ספירלה יש לאחסן פתרון 0.05MH 3 4 ת.ד. ב 4 ° C. 2. הפחתת וירוס שיטת הפקה ויראלי (וילהלם et al. 2002) עד 500 מ"ל של מי ים מדגם / lakewater עם שני מארח ווירוסים מתקבל והניח ביחידה sterifilter עם 0.2-מיקרומטר הנומינלי נקבוביות גודל נמוך חלבון מחייב סינון (למשל, Durapore) הניח על זה. המדגם בעדינות אבק לחץ על 200 מ"מ כספית <בעוד הרף resuspending המדגם בעזרת פיפטה סטרילית העברת לעכב תאים חיידקיים מן להתרכז המסנן. לאט לאט שלושת הכרכים של ultrafiltrate מתווספים ההשעיה חיידקי כדי להפחית באופן משמעותי את מספר וירוסים חינם במדגם. חלק חיידקי הוא מדולל בחזרה 500 מ"ל מים עם וירוסים חינם מחולק לשלושה משכפל של 150 מ"ל כל ממוקמים בקבוקי 250 מ"ל ברור פוליקרבונט. 3. תזרים משיק סינון (TFF) שיטת ייצור ויראלי (Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005) TFF מייצג גישה חלופית לשיטת הפחתת ויראלי. כ 500 מ"ל של המדגם טבעי נאסף כמתואר לעיל. מדגם זה מרוכזת באמצעות-0.2 מיקרומטר הנומינלי נקבוביות בגודל משיק מערכת סינון לזרום. כאשר חלק חיידקי מצטמצם בערך 10-15 מ"ל, ultrafiltered, וירוס ללא מים הוא הוסיף ומופץ לעיל. הבקבוקים לשכפל מודגרת בבית בתנאים באתרו שימוש בתאי הסביבה. רמות אור משתנים תנאי השטח באמצעות הכחלחלה אקרילי אקריליק או לנקות עם הקרנת נטו לירידה בעוצמת האור. טמפרטורות פני השטח אמביינט מתקבלים לעתים קרובות באמצעות מי ים זורמים הסיפון חממה. דוגמאות עבור הערכות שפע חיידקים ווירוסים נלקחים בזמן 0 עם ריכוז סופי של glutaraldehyde סטרילי 2.0-2.5% נוסף לתוך cryovials. דגימות אלה מיד פלאש קפוא עם חנקן נוזלי ומאוחסנים עד קפוא מעובד. אם חנקן נוזלי אינו זמין, שקופיות מיקרוסקופ עשוי להיות מוכן ומעובד באופן מיידי (ראה נוהל להלן) Subsamples נאספים כל 2.5 שעות לפחות 10 שעות על ידי השיטה המתוארת לעיל. באותה מים הפעם עשוי להיאסף לניתוח PCR כמותי. עד 5 מ"ל של המדגם ניתן להוסיף cryovial עם סוכן לא מקבע עם הקפאת פלאש מיידית חנקן נוזלי. 4. הפקה מיקרוסקופית ויראלי (נובל & Fuhrman 1998, ון et al. 2004) דגימות קפואות להיות 0.02-מיקרומטר סינון עבור מיקרוסקופיה צריך להיות מופשר על הקרח. הכן פתרון המניות של SYBR הירוק על ידי דילול פתרון 1:10 המניה עם מים סטריליים. בשלב הבא, מפתרון המניות, להכין עבודה על ידי הוספת פתרון 1mL הפתרון המניות של 39 מ"ל מים סטריליים. גליצרול 50%, פוספט 50% שנאגרו פתרונות מלוחים (PBS, 0.05 M Na 2 HPO 4, 0.85% NaCl, pH 7.5) ומלאי טרי פתרון 2.5% phenylenediamine-p צריך גם להיות מוכן לפני תחילת. שמור על 50% glycerol/50% פתרון PBS ב 4 ° C ו-p phenylenediamine המניה ב -20 ° C בחושך עד ההתחלה. ממש לפני הסינון מוסיפים את p-phenylenediamine של 50% PBS glycerol/50% ריכוז סופי של 0.1% כדי לשמש כפתרון Antifade. מניחים 25 מ"מ 0.02-מיקרומטר לסנן Anodisc על גבי MicronStep 0.45-מיקרומטר, מסנן גיבוי מתאית. הוספת 850 μL המדגם קבוע לחלק העליון של Anodisc ואקום ב PKA 20 עד יבש לחלוטין. 100 מקום μL הפתרון הירוק SYBR הפועלים צלחת פטרי סטרילית, עם הריק עדיין בזהירות להסיר את Anodisc ממגדל מקום לסנן על הירוק SYBR. דגירה דגימות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. בזהירות להסיר את המסנן מפתרון SYBR הירוק הפתיל האחורי של המסנן עם Kimwipe כדי להסיר את כל שאריות צבע. אם תרצה, תוכל להחזיר את המסנן למגדל ולהעביר עד 800 μL של מים מסוננים 0.02-מיקרומטר או מדיה סטרילית דרך המסנן כדי לשטוף את הכתם עודף. הוסף טיפה קטנה של פתרון antifade לשקופית המיקרוסקופ במקום להחליק על גבי העטיפה. הסר את תלוש לכסות ולהוסיף את מסנן יבשים לשקופית מיקרוסקופ רטוב עם פתרון antifade. שוב, להוסיף כמות קטנה של פתרון antifade להחליק את המכסה לאט למקם אותו על גבי המסנן, מוודא להיפטר מכל הבועות כי עלול להיווצר. מיד להקפיא את השקופיות ב -20 ° C עד הצורך (אלה יש להשתמש תוך כמה חודשים כדי למנוע דהייה והוריד ספירת וירוס) וירוסים הם המנויים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (במקרה שלנו מיקרוסקופ DMRXA לייקה) עם סט רחב מסנן כחול (אקס λ = 450-490 nm, λ = 510 nm Em עם מסנן דיכוי ב λ = 510 ננומטר). כל מסנן יהיה לפחות 20 שדות הראייה נספר, מוודא לכמת וירוסים סך מרשת כל שדה כדי להבטיח אפילו הפצה של וירוסים דרך הממברנה את המסנן. שיעור ממוצע של הישנותם וירוס משלושת עצמאית משכפל מחושבים אז סטיית התקן נקבעת שיעורי הייצור. 5. נציג תוצאות הנתונים הגולמיים שנאספו על ידי החוקר דורש עיבוד מתמטי מינימלי כדי לייצר שיעורי הישנותם של שפע וירוס. קבוצת הנתונים העיקרי הנובע מחקר זה היא שיעורי הישנותם של שפע וירוס ב subsamples מ incubations. תוצאות אלו בצורה עצמאית רגרסיות שפע של זמן לעומת וירוס עבור כל אחת מהדגימות. עבור כל דגימה incubations הפרט לפעול כמו טיפול אחד, אז על ידי השלמת three-לשכפל incubations החוקר יכול לחשב שיעורי כמו גם אומדן של שונות (למשל, סטיית תקן) (ראה איור 1). אזהרה אחת של תהליך זה היא כי ירידה קבועה שפע וירוס מוביל לירידה בתאי המארח במדגם כי הם שנשאו בנטל וירוס. כדי לקזז את ההפסד הזה, ספירה של שפע חיידקי ממקור שני (מי ים או מים מסוננים האגם) ו T = 0 מדגם הדגירה נחוצים. מידע זה יכול לשמש כדי להסביר את האחוז של תאים שאבדו: בהנחה כי תהליך הפחתת שפע וירוס אינה סלקטיבית בעד או נגד כל חברי הקהילה חיידקים, גורם זה יכול לשמש כדי לאמוד את קצב הפקת באתרו של וירוסים . באיור 1. הייצור של דגימות נגיף דמוי חלקיקים מעל הדגירה של 10 שעות בבית בתנאים באתרו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. נאספו במהלך הפיטופלנקטון פריחה לחופי ניו זילנד בספטמבר 2008. איור 2. תרשים סכמטי של תהליך זרימת עבודה עבור ייצור assaying וירוס. התהליך מתחיל עם ultrafiltration המים מדגם ליצור וירוס ללא מים. זהו השלימה באמצעות מערכת ultrafiltration. בדגימות מים במקביל נאספים מאותו אתר ואת וירוסים חינם עברו דרך פילטר בעוד הקהילה חיידקים (המכיל תערובת של תאים נגועים ולא נגועים) נשמרת. קהילה זו היא resuspended אז במים וירוס בחינם מודגרות תחת בתנאים באתרה. שיעור הישנות של וירוסים מנוטר אז במשך 10 השעות הבאות כדי לקבוע שיעורי הייצור וירוס.