Avaliação da função cardíaca e Energetics em Corações Isolados rato Usando ³¹ P NMR Spectroscopy

Para estes experimentos, dois sistemas separados são utilizados simultaneamente. Para aquisição de 31 espectros de P, um ímã Bruker 14T é a interface com o III Avance console e um computador equipado com software TopSpin V2.1. Para avaliação da função cardíaca, um sistema de perfusão personalizado construído coração está conectado com o PowerLab 30/04 aquisição de dados, equipada com os 6 LabChartPro software para análise de dados. No dia do experimento, 1 litro de Krebs-Henseleit tampão é preparado da seguinte forma: 0,5 mM EDTA, 5,3 mm KCl, 1,2 mm MgSO 4, 118mm NaCl e 25mM NaHCO 3. A mistura é então borbulhado com 5% de CO 2 / O 2 95% por 10-15 minutos antes da adição de 2mM CaCl 2. Finalmente, substratos, na forma de glicose 10 mM e 0,5 mM de piruvato, são adicionados. Regulação da temperatura durante a experiência é fundamental. Circuladores aquecida são usados ​​para manter a temperatura entre 37,0-37,5 ° C, enquanto o coração está dentro do ímã. A temperatura é monitorada para a duração do experimento usando uma sonda de temperatura de fibra óptica. Pressão de perfusão ea pressão ventricular esquerda são monitorados através de transdutores de pressão ligados a um sistema de aquisição de dados e exibidos utilizando o software incluído. Estes são calibrados com um esfigmomanômetro padrão antes do experimento. Além disso, linhas de pressão são liberadas de forma adequada, a fim de remover todas as bolhas de ar. A amostra padrão de 150 mM fosfato de sódio (que é equivalente à força iônica do tampão KH) é usado para "calibrar" a sonda antes da inserção do coração. Isso facilita o sinal e diminui o tempo necessário para começar o período de aquisição uma vez que o coração está posicionado dentro da sonda. Para reduzir a coagulação, o mouse é injetado com 200 unidades de heparina IP Depois de 5 minutos, sódio IP (175 mg / kg) pentobarbital é dado. O coração é rapidamente retirado (com os pulmões eo timo intacta) e preso no gelo frio KH buffer. Enquanto mantidos em gelo, os pulmões são rapidamente removidas. Os lobos do timo são identificados e delicadamente descascadas volta para expor a aorta. O timo é removido. A aorta é então isolado pela remoção cuidadosa de qualquer tecido circundante. Forceps Micro sutura são usados ​​para segurar delicadamente ambas as paredes da aorta para expor o lúmen. A aorta é cuidadosamente colocada sobre a cânula feita de tubo de polietileno 0,965 mm de diâmetro externo (PE50). A aorta é mantida no lugar com uma braçadeira navio micro, enquanto as suturas são rapidamente amarrado ao redor da aorta. O clipe é removido e as pinças são usadas para verificar cuidadosamente que a cânula está acima da raiz da aorta. Vínculos adicionais são adicionados como necessário para manter o coração no lugar. Qualquer tecido extra é removida com fórceps e microtesoura. Uma pequena incisão é feita na aurícula esquerda. A tubulação de polietileno de 0,61 milímetros OD (PI10) é cuidadosamente inserido através do átrio esquerdo, cavidade do VE, e para fora através do ápice, enquanto delicadamente segurando o coração. A tubulação em excesso é aparado. A deflacionado balão cheio de água é introduzido através do átrio para o LV e é mantida no lugar usando fita adesiva ou suturas. A velocidade da bomba peristáltica é gradualmente aumentada para fornecer fluxo suficiente para o coração. Até que o coração é lugar para a sonda de RMN, o coração vai continuar a ser perfundidos com fluxo constante equivalente a aproximadamente 2 ml / min. O balão é inflado LV com um pequeno volume, utilizando uma seringa micrométrica para verificar se o transdutor de pressão LV está funcionando. O coração é cuidadosamente inserido em um tubo de RMN 10 mm. Uma ampla furo "giratório" é usado para ajudar a orientar o tubo na posição adequada dentro da sonda. Todo o aparato é, então, firmemente ligado ao "cordão umbilical" com fita adesiva. O cordão umbilical é lentamente abaixado no furo superior do ímã até o tubo de coração / NMR está dentro da bobina da sonda 10 milímetros de RMN. Uma vez que o coração está na posição adequada dentro da sonda, a vazão da bomba peristáltica é ajustado de forma a atingir uma pressão de perfusão de 80mmHg. (Lembre-se que até este ponto, o coração foi perfundido com um fluxo constante de aproximadamente 2 ml / min). A pressão de perfusão é então mantida, permitindo que o "hold" mecanismo no controlador de bomba. O coração é então permitido um período de equilíbrio 15-20 minutos. Durante esse tempo, o volume do balão LV é ajustada para atingir uma pressão final diastólica de 8-10 mmHg. Durante o período de equilíbrio, é necessário otimizar os parâmetros espectrômetro a fim de obter o sinal de fósforo melhor possível. Isto é conseguido através da criação do pulso de rádio na frequência a qual o núcleo de fósforo ressoa ("tuning") e fazendo o campo magnético homogêneo ("calços"). Após o período de equilíbrio, vários espectros de RMN 31 P pode ser obtida. O período de aquisição de cada espectro é dependente de tele força do campo do ímã, do tamanho da amostra, ea relação sinal-ruído requerida para um experimento específico. Espectros são obtidos utilizando um ímã 14 Telsa pela média do sinal obtido a partir de 256 pulsos de rádio freqüência de 20 mS com um ângulo de 60 graus flip e atrasos de 2,0 segundos. Esta experiência vai exigir cerca de 10 min. Resultados representante Do hardware de aquisição de dados eo software LabChart, vários parâmetros da função cardíaca pode ser medido ao longo do protocolo experimental. A medida típica da função cardíaca, a pressão ventricular esquerda desenvolvidos (LVDevP), é obtida pela subtração da pressão diastólica final (EDP) a partir da pressão sistólica (Figura 1). Esta medida pode variar dependendo da estirpe do mouse ea condição do coração (ou seja, a sobrecarga de pressão). No entanto, em um normal LVDevP coração C57BL6 mouse é normalmente entre 100-110 mmHg na pressão diastólica final fixo de 10/08 mmHg. Além disso, o programa permite LabChart para a medição da freqüência cardíaca baseada nas medidas cíclica das ondas de pressão do VE. Novamente, esta medida pode variar, mas valores típicos são 350-400 bpm quando os corações estão autorizados a bater a taxas intrínsecas. No entanto, o coração pode ser padronizado utilizando um sistema de estimulação onde a freqüência cardíaca é mantida a 420 bpm. Além disso, medidas de contratilidade (+ dP / dt) e relaxamento (-dP/dt) pode ser estimada utilizando a primeira derivada da onda de pressão do VE. Durante o protocolo experimental é fácil avaliar o mecanismo de Starling, incorporando uma relação pressão-volume. Isto é conseguido através de aumentos graduais no balão LV e observando o LVDevP, bem como a EDP. Estes valores podem ser representados como mostrado na Figura 2. Enquanto a curva de Starling é o ideal, observando o volume necessário para atingir uma EDP de 8-10 mmHg pode dar uma idéia indireta de LV dimensão câmara. Isto pode ser usado em modelos de bandagem aórtica como corações hipertrofiados normalmente exigirá um volume menor balão enquanto corações dilatados requerem um volume maior quando comparados aos controles. A Tabela 1 apresenta dados representativos função cardíaca como adquiridos durante o protocolo de perfusão. O espectrômetro de RMN 31 P irá fornecer sinais de fosfocreatina (PCr) e os três fosfatos do ATP (ATP-γ, α-ATP, e β-ATP), bem como fosfato inorgânico (Pi), conforme mostrado na Figura 2. Análise de cada um desses picos fornece um valor para a área sob a curva. A quantidade de ATP é estimada pela média das γ-ATP e β-ATP áreas. (O α-ATP não é utilizada porque as moléculas de NAD contribuir para uma parte desconhecida do sinal total). O status energético do coração é determinado pelo quociente da PCr e áreas ATP (PCr: relação ATP). Esse valor é normalmente 1,5-1,7 em um coração de rato fornecido com a glicose como substrato primário. Embora 31 P NMR não fornece medidas diretas de ATP ou PCr, a área dos picos é proporcional à quantidade de fósforo contendo compostos na amostra. Valores para esses sinais podem ser estimados por outros métodos. Por exemplo, medidas diretas de ATP por cromatografia líquida (HPLC) em uma coorte de coração pode produzir uma concentração média. Este valor pode então ser usada para calibrar o ATP áreas médias observadas nos espectros. A concentração de PCr pode ser calculada com base na área PCr relativa à área de ATP. Também é possível estimar pH, analisando o deslocamento químico relativa do fosfato inorgânico (Pi) de sinal para o sinal de PCr. 1 Usando seqüências de pulsos de rádio diferentes, a velocidade de reação da creatina quinase ATP ou a velocidade de reação de síntese também pode ser medido. 2 Tabela de funções da linha de base 1. Cardíaca de corações isolados perfundidos. LVDevP: pressão ventricular esquerda desenvolvidos; PDFVE: final do ventrículo esquerdo pressão diastólica; FC: freqüência cardíaca; RPP: produto pressão taxa; + dP / dt: primeiro LV pressão derivada positiva; -dP/dt: primeiro LV pressão derivada negativa; PP : pressão de perfusão; CF: fluxo coronariano. Figura 1. Representante LV ondas de pressão de LabChart software Pro. Figura 2. Curvas de Starling Representante do controle (linha sólida) e em faixas aórtica (linha pontilhada) camundongos. A) função sistólica, representado por mais de LVDevP volumes crescentes LV, conforme determinado pelo volume do balão LV. B) A função diastólica como representado pela EDP sobre volumes crescentes LV, conforme determinado pelo volume do balão LV. LVDevP: pressão do ventrículo esquerdo desenvolveu (sistólica menos p diastólicaressure); EDP: pressão diastólica final. Figura 3. Representante 31 P espectros de RMN de coração de rato isolado perfundido. Observe o relativamente pequeno pico Pi. Em um coração aerobicamente perfundidos fornecido com ácidos graxos ou piruvato, além de glicose, o pico deve ser mínima. Durante os períodos de isquemia, o que aumenta de pico, enquanto o pico PCr diminui. Observe o ombro para a direita do pico de α-ATP. Esta é a contribuição de moléculas de NAD. Pi: fosfato inorgânico; PCr: fosfocreatina; ATP: adenosina trifosfato.