تقييم وظيفة القلب وعلم الطاقة في قلوب معزولة عن طريق الماوس 31 P الرنين المغناطيسي الطيفي
Summary
Langendorff وضع التروية القلبية معزولة ، بالاشتراك مع<sup> 31</sup> P الرنين المغناطيسي الطيفي ، يجمع بين مجالات الكيمياء الحيوية وعلم وظائف الأعضاء في تجربة واحدة. ويسمح البروتوكول لقياس ديناميكية عالية الطاقة محتوى الفوسفات ودوران في القلب في حين رصد في الوقت نفسه وظيفة فيزيولوجية. عندما يقوم بشكل صحيح ، وهذا هو أسلوب قيمة في تقييم علم الطاقة القلبية.
Abstract
فقد أصبحت النماذج الماوس راثيا أدوات البحث القوية في تحديد العلاقات السببية بين التغيرات الجزيئية ونماذج من مرض القلب والأوعية الدموية. على الرغم من أن البيولوجيا الجزيئية هو ضروري في تحديد تغييرات رئيسية في مسار الإشارات ، فإنه ليس هناك بديل عن أهمية وظيفية. في حين يمكن أن تقدم إجابات الفيزيولوجيا إلى مسألة مهمة ، والجمع بين علم وظائف الأعضاء مع تقييم البيوكيميائية الأيضات في سليمة ، وضرب قلب يسمح للحصول على صورة كاملة من وظيفة القلب وعلم الطاقة. لسنوات ، وقد استخدمت مختبرنا perfusions القلب المعزولة جنبا إلى جنب مع التحليل الطيفي المغناطيسي النووي (NMR) صدى لإنجاز هذه المهمة. ويتم تقييم وظيفة البطين الأيسر عن طريق وضع Langendorff perfusions القلب المعزولة في حين يقاس علم الطاقة عن طريق أداء القلب<sup> 31</sup> P الطيفي بالرنين المغناطيسي للقلوب perfused. مع هذه التقنيات ، يمكن قياس مؤشرات وظيفة القلب في تركيبة مع مستويات فسفوكرياتين والضرب للاعبي التنس المحترفين في وقت واحد في القلوب. وعلاوة على ذلك ، يمكن رصد هذه المعايير وضعت في حين أن الضغوطات فيزيولوجي أو مرضي. على سبيل المثال ، يمكن اعتماد نقص التروية / أو ضخه عالية بروتوكولات التحدي عبء العمل. استخدام النطاقات الأبهري أو نماذج أخرى من أمراض القلب هي عرضة أيضا. بغض النظر عن المتغيرات ضمن البروتوكول ، يمكن أن أهمية وحيوية وظيفية من التعديلات الجزئية للنماذج الماوس المعدلة وراثيا صفها على نحو كاف ، مما يؤدي إلى رؤى جديدة في مسارات المرتبطة الأنزيمية والأيض. لذلك ،<sup> 31</sup> P الرنين المغناطيسي الطيفي في قلب perfused معزولة هو أسلوب البحوث القيمة في النماذج الحيوانية لمرض القلب والأوعية الدموية.
Protocol
Discussion
31 ف الرنين المغناطيسي الطيفي في قلب Langendorff – perfused الماوس معزولة توفر بيانات موثوقة وقابلة للتكرار 3 و 4 ومع ذلك ، فمن الضروري أن تتم إقناء ؛ إدخال القنية من الشريان الأورطي وإدخال البالون LV هذه بشكل صحيح للسماح للأداء القلب مستقرة بينما داخل NMR الأنبوب. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تنظيم درجة الحرارة القصوى من أجل تحقيق السليم وظيفة أساسية. واحد العوامل المهمة في الحصول على جيد ، أطياف الرنين المغناطيسي للتحليل هو زيادة إشارة إلى نسبة الضوضاء. ويمكن تحقيق ذلك من خلال ضمان الأمثل "ضبط" و "الملئ" على عينة. كما ورد في نص البروتوكول ، ويمكن استخدام نموذج قياسي قبل الإدراج للقلب تسهيل ذلك. ومن المفيد أيضا أن يكون لها الحجم الكافي "عينة". قلوب وزنها أقل من 100 ملغ توفر عادة أقل PCR وإشارات ATP ذلك الزيادات في وقت الاستحواذ سيكون من الضروري الحصول على أطياف جيدة الفوسفور.
هناك عدة طرق لتعديل بروتوكول القائمة لجمع معلومات إضافية بشأن وظيفة القلب وعلم الطاقة. في المختبر لدينا ، ونحن قلوبنا مع perfused مخازن مختلطة الركيزة التي يمكن أن تشمل وجود تركيبات مختلفة من الأحماض الدهنية (في تركيزات منخفضة ومرتفعة) ، وأملاح ، الكيتونات ، والانسولين. مع استخدام النظائر المستقرة في المنطقة العازلة التروية (أي 13 C المسمى ركائز) ، ونحن نمتلك القدرة على تقدير استخدام الركيزة التي المساهمة النسبية للأسيتيل التميم المسمى لدورة TCA. 5-7 للحصول على هذا التطبيق ، ونحن أداء isotopomer تحليل C3 – 13 و 13 الغلوتامات C4 – 13 مع مطياف الرنين المغناطيسي C. وهذا يتطلب تجميد لقط القلب في نهاية البروتوكول نضح وإجراء عملية استخراج الانسجة المجمدة. وسوف تكون هذه التجربة إضافية حسب التحليل يتطلب استخدام مسبار مختلفة مع معلمات الإعداد منفصلة. تطبيقات أخرى تشمل استبدال السكر مع deoxyglucose في المنطقة العازلة في حين رصد تراكم تعتمد على الوقت من 2 deoxyglucose الفوسفات في القلب باستخدام الرنين المغناطيسي الطيفي 31 ف. هذا الأسلوب يسمح لقياس امتصاص الغلوكوز عضلة القلب. 7 ، 8 وبالإضافة إلى ذلك ، لدينا مختبر وحللت وظيفة القلب وعلم الطاقة في بروتوكولات نضح تتألف من نقص التروية / ضخه ، وارتفاع عبء التحدي 6 ، 10/08
باختصار ، ف 31 الطيفي NMR في قلوب الماوس معزولة هو إجراء تحديا تقنيا التي تتطلب استخدام معدات متطورة. ومع ذلك ، فإن البيانات التي لا تقدر بثمن لغلة الباحث الذي يرغب في تحليل وظيفة و طاقة من نماذج الماوس راثيا. لدينا مختبر ، كانت هذه التقنيات الحيوية في فهمنا لعواقب مجموعة متنوعة من الضغوطات على وظيفة القلب ، وعلم الطاقة ، والتمثيل الغذائي 1 ، 11 ، 12
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر لين سبنسر عن دعمها أثناء الجزء الطيفي للتجربة الرنين المغناطيسي النووي. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة تمويل HL059246 R01 ، R01 HL067970 ، R01 HL088634 (للدكتور تيان) و F32 HL096284 (للدكتور Kolwicz).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Magnesium Sulfate | Reagent | Sigma Aldrich | M7506 |
| EDTA | Reagent | Sigma Aldrich | E1644 |
| Potassium chloride | Reagent | Sigma Aldrich | P4505 |
| Sodium bicarbonate | Reagent | Sigma Aldrich | S6297 |
| Sodium chloride | Reagent | Sigma Aldrich | S7653 |
| Calcium chloride dihydrate | Reagent | Sigma Aldrich | C5080 |
| D-Glucose | Reagent | Sigma Aldrich | G7528 |
| Sodium Pyruvate | Reagent | Sigma Aldrich | P2256 |
| Bruker Ultrashield 600WB Plus | Equipment | Bruker | |
| PowerLab 4/30 | Equipment | ADInstruments | ML866/P |
| LabChart 6 Pro | Equipment | ADInstruments | MLS260/6 |
| Quad Bridge Amp | Equipment | ADInstruments | ML224 |
| STH Pump Controller | Equipment | ADInstruments | ML175 |
| Minipuls 3 Peristaltic Pump | Equipment | ADInstruments | ML172 |
| Disposable BP Transducer | Equipment | ADInstruments | MLT0699 |
| 10mm NMR Sample Tube | Equipment | Wilmad LabGlass | 513-7PP-7 |
| Polyethylene tubing PE10 | Equipment | Becton-Dickinson | 427401 |
| Physiological Pressure Transducer | Equipment | ADInstruments | MLT844 |
| Polyethylene tubing PE50 | Equipment | Becton-Dickinson | 427411 |
| Micrometer syringe | Equipment | Gilmont Instruments | GS-1101 |
| McPherson Forceps | Equipment | Miltex Inc. | 18-949 |
| Castraviejo microscissors | Equipment | Roboz Surgical Instruments | RS-5650 |
| Neoptix Signal Conditioner | Equipment | Neoptix, Inc. | Reflex – 1 |
References
- Nascimben, L., Ingwall, J. S., Lorell, B. H., Pinz, I., Schultz, V., Tornheim, K., Tian, R. Mechanisms for increased glycolysis in the hypertrophied rat heart. Hypertension. 44, 662-667 (2004).
- Spindler, M., Saupe, K. W., Tian, R., Ahmed, S., Matlib, M. A., Ingwall, J. S. Altered creatine kinase enzyme kinetics in diabetic cardiomyopathy. A(31)P NMR magnetization transfer study of the intact beating rat heart. J Mol Cell Cardiol. 31, 2175-2189 (1999).
- Ingwall, J. S. Phosphorus nuclear magnetic resonance spectroscopy of cardiac and skeletal muscles. Am J Physiol. 242, H729-H744 (1982).
- Ingwall, J. S., Javadpour, M. M., Miao, W., Hoit, B. D., Walsh, R. A. 31P NMR spectroscopy of the mouse heart. Cardiovascular physiology in the genetically engineered. , 151-163 (2002).
- Luptak, I., Balschi, J. A., Xing, Y., Leone, T. C., Kelly, D. P., Tian, R. Decreased contractile and metabolic reserve in peroxisome proliferator-activated receptor-alpha-null hearts can be rescued by increasing glucose transport and utilization. Circulation. 112, 2339-2346 (2005).
- Yan, J., Young, M. E., Cui, L., Lopaschuk, G. D., Liao, R., Tian, R. Increased glucose uptake and oxidation in mouse hearts prevent high fatty acid oxidation but cause cardiac dysfunction in diet-induced obesity. Circulation. 119, 2818-2828 (2009).
- Luptak, I., Shen, M., He, H., Hirshman, M. F., Musi, N., Goodyear, L. J., Yan, J., Wakimoto, H., Morita, H., Arad, M., Seidman, C. E., Seidman, J. G., Ingwall, J. S., Balschi, J. A., Tian, R. Aberrant activation of AMP-activated protein kinase remodels metabolic network in favor of cardiac glycogen storage. J Clin Invest. 117, 1432-1439 (2007).
- Xing, Y., Musi, N., Fujii, N., Zou, L., Luptak, I., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J., Tian, R. Glucose metabolism and energy homeostasis in mouse hearts overexpressing dominant negative alpha2 subunit of AMP-activated protein kinase. J Biol Chem. 278, 28372-28377 (2003).
- Luptak, I., Yan, J., Cui, L., Jain, M., Liao, R., Tian, R. Long-term effects of increased glucose entry on mouse hearts during normal aging and ischemic stress. Circulation. 116, 901-909 (2007).
- Tian, R., Abel, E. D. Responses of GLUT4-deficient hearts to ischemia underscore the importance of glycolysis. Circulation. 103, 2961-2966 (2001).
- Liao, R., Jain, M., Cui, L., D’Agostino, J., Aiello, F., Luptak, I., Ngoy, S., Mortensen, R. M., Tian, R. Cardiac-specific overexpression of GLUT1 prevents the development of heart failure attributable to pressure overload in mice. Circulation. 106, 2125-2131 (2002).
- Tian, R., Musi, N., D’Agostino, J., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J. Increased adenosine monophosphate-activated protein kinase activity in rat hearts with pressure-overload hypertrophy. Circulation. 104, 1664-1669 (2001).
