מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry
Summary
מאמר זה יפרט את הפרוטוקול למדידת פעילות calpain בתאים קבועים חי באמצעות cytometry הזרימה.
Abstract
Calpains נמצאים בכל מקום תאיים, סידן רגיש, פרוטאזות ציסטאין נייטרלי<sup> 1</sup>. Calpains ממלאים תפקידים מכריעים תהליכים פיזיולוגיים רבים, כולל איתות, שיפוץ cytoskeletal, רגולציה של אפופטוזיס ביטוי גנים התקדמות מחזור התא<sup> 1</sup>. Calpains היו מעורבים רבים, כולל מחלות dystrophies שרירים, סרטן, סוכרת, אלצהיימר וטרשת נפוצה<sup> 1</sup>. Calpain תקנה מורכב מובנת. רמות ה-mRNA וחלבון לתאם היטב עם פעילות, הגבלת שימוש בטכניקות של גן או חלבון הביטוי כדי למדוד את פעילות calpain. פרוטוקול זה מפרט וידאו assay תזרים cytometric שפותחו במעבדה שלנו למדידת פעילות calpain בתאים חיים קבוע. שיטה זו משתמשת המצע פלורסנט BOC-LM-CMAC, אשר ביקע במיוחד על ידי calpain, כדי למדוד את פעילות calpain.<sup> 2</sup> בסרטון הזה, פעילות calpain ב קבוע וחיים Murine לוקמיה תאים 32Dkit, לבד או כחלק אוכלוסייה splenocyte נמדדת באמצעות LSRII (BD Bioscience). תאים 32Dkit הם הראו פעילות גבוהות לעומת splenocytes נורמלי.
Protocol
Discussion
הפעילות calpain בתאים 32Dkit קבוע וחיים נקבע בפרוטוקול הווידאו הזאת. טיפול קו התא עם מעכב calpain PD150606 הביא עיכוב מלא של פעילות calpain בתאים. בנוסף, טיפול מעכב MEK1 PD98059 הביא עיכוב מלא של פעילות calpain בתאים. ERK הוא activator העיקריים של calpain-2 3. התוצאות מראות כי calpain-2 הפעילות העיקרי בתא…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נתמך על ידי מענקים מכוני הקנדי לחקר בריאות, לוקמיה לימפומה וחברה של קנדה וקרן לימפומה של קנדה.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde |
Invitrogen | Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C |
||
| PD150606 | Invitrogen | Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition. | ||
| PD98059 | Cell Signaling Technology | |||
| AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes |
Invitrogen | |||
| LSR II | BD Bioscience | Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. |
References
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. . The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).
