フローサイトメトリーで固定し、生細胞におけるカルパイン活性の測定
Summary
この記事では、フローサイトメトリーを用いて固定し、生きた細胞内のカルパイン活性を測定するための詳細プロトコルを務める。
Abstract
カルパインは、ユビキタス細胞、カルシウム感受性、中立的なシステインプロテアーゼです。<sup> 1</sup>。カルパインは、シグナル伝達、細胞骨格のリモデリング、遺伝子発現の調節、アポトーシスや細胞周期の進行を含め、多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす<sup> 1</sup>。カルパインは、筋ジストロフィー、癌、糖尿病、アルツハイマー病や多発性硬化症を含む多くの病理に関与している<sup> 1</sup>。カルパイン規制は複雑で、完全には理解です。 mRNAおよびタンパク質レベルでは、カルパイン活性を測定するための遺伝子またはタンパク質の発現技術の使用を制限し、活動にあまり相関しない。このビデオのプロトコルの詳細については、固定および生細胞中のカルパイン活性を測定するための我々の研究室では、フローサイトメトリーアッセイを開発した。このメソッドは、カルパインにより特異的に切断される蛍光基質BOC – LM – CMACは、、カルパイン活性を測定するために使用します。<sup> 2</sup>このビデオでは、固定および生体マウス32Dkitの白血病細胞、単独で、または脾細胞集団の一部としてのカルパイン活性はLSRII（BDバイオサイエンス）を用いて測定されます。 32Dkit細胞は、正常脾細胞と比較して上昇活性を有することが示されている。
Protocol
Discussion
固定と生活32Dkit細胞におけるカルパイン活性はこのビデオのプロトコルで決定されている。カルパイン阻害剤PD150606を有する細胞系の治療は、細胞内のカルパイン活性の完全な阻害をもたらした。さらに、MEK1阻害剤PD98059による治療は、細胞内のカルパイン活性の完全な阻害をもたらした。 ERKは、カルパイン- 2 3の主要な活性剤です。これらの結果は、カルパイン- 2活性が32Dkit細胞で?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
保健研究、カナダの白血病とリンパ腫協会とカナダのリンパ腫財団のカナダの協会からの補助金によって支え。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde |
Invitrogen | Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C |
||
| PD150606 | Invitrogen | Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition. | ||
| PD98059 | Cell Signaling Technology | |||
| AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes |
Invitrogen | |||
| LSR II | BD Bioscience | Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. |
References
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. . The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).
