التخيل والكمي لالتفاعلات داخل الخلايا النيسرية السحائية والإنسان α - actinin بواسطة التصوير متحد البؤر
Summary
يمكن النيسرية السحائية (نيوتن متر) ، وهي سلبية غرام الممرض التنفسي للإنسان على وجه التحديد ، ربط الإنسان actinin – α. هنا نقدم بروتوكول للتصور colocalisation للبكتيريا مع الخلايا α – actinin بعد دخول البكتيريا إلى خلايا الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البطانية (HBMECs).
Abstract
البروتين بمسانده من النيسرية السحائية (نيوتن متر ، المكورة السحائية) هي أرض لا يتجزأ من البروتين وأعربت الغشاء الخارجي ، والتي يمكن أن تكون بمثابة adhesin وفعالة لالإنفازين الإنسان الخلايا الظهارية والبطانية. حددنا البطانية ارض تقع لل integrins باسم المستقبلات الرئيسية لمكتب أمين المظالم ، وهي عملية تتطلب OPC لربط أول يغاندس إنتغرين مثل vitronectin وعبر هذه إلى خلايا مستقبلات أعرب 1. هذه العملية يؤدي إلى الغزو الجرثومي للخلايا بطانة الأوعية الدموية 2. في الآونة الأخيرة ، لاحظنا التفاعل مع بمسانده من البروتين الموجود في 100kDa lysates خلية كاملة من الخلايا البشرية 3. لاحظنا في البداية هذا التفاعل عندما بروتينات الخلية المضيفة مفصولة الكهربي ونشف إلى النيتروسليلوز كانوا مضافين مع OPC ، معربا عن نيوتن متر. كان التفاعل المباشر ، ولم يتضمن جزيئات متوسطة. بواسطة مطياف الكتلة ، أنشأنا هوية البروتين كما α – actinin. كما أعرب عن أي سطح عثر α – actinin على أي من خطوط الخلايا eight فحصها ، كما والتفاعلات OPC مع الخلايا البطانية في وجود الرصاص في الدم للدخول البكتيريا الى الخلايا المستهدفة ، ونحن دراسة إمكانية التفاعل البروتينين intracellularly. لهذا ، أصيب الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري مثقف الخلايا البطانية (HBMECs) مع OPC ، معربا عن نيوتن متر لفترات طويلة والمواقع من البكتيريا والمنضوية α actinin ، تم فحص المجهري متحد البؤر التي كتبها. لاحظنا الوقت التي تعتمد على زيادة في colocalisation نيوتن متر من البروتين مع هيكل الخلية ، التي كانت كبيرة بعد فترة ثماني ساعات من تدخيل البكتيرية. بالإضافة إلى ذلك ، مكن استخدام برامج التصوير الكمي لنا للحصول على قياس نسبي لcolocalisation نيوتن متر مع α – actinin هيكل الخلية والبروتينات الأخرى. هنا نقدم بروتوكول للمرئيات والكمي لcolocalisation للبكتيريا مع البروتينات داخل الخلايا البكتيرية بعد دخوله إلى الخلايا البطانية الإنسان ، على الرغم من أن هذا الإجراء ينطبق أيضا على الخلايا الظهارية البشرية.
Protocol
Discussion
إمكانية ربط المنضوية OPC ، معربا عن النيسرية السحائية لα – actinin تم استكشافها من قبل باستخدام HBMEC فحص colocalisation من البكتيريا والبروتين هيكل الخلية في الخلايا المصابة بعد 3 و 8 فترة حضانة ح. بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر ، يمكن أن يكون أظهر colocalisation من النيسرية السحائية مع α – actinin. على وجه الخصوص ، على الرغم من أن البكتيريا المنضوية في 3 ساعات ، كان هناك القليل مع colocalisation α – actinin في هذه النقطة الزمنية. وكانت أعداد كبيرة من الجراثيم البكتيرية الجمعيات مع هيكل الخلية البروتين يبدو بحاجة إلى فترة أطول من الإقامة داخل الخلايا وبعد فترة العدوى ح 8 ، α – actinin على ما يبدو في ارتباط وثيق. ألفا actinin هو بروتين متعددة الوظائف ، والتفاعلات البكتيرية مع هيكل الخلية يمكن أن يكون عنصر تأثير كبير على وظيفة خلايا الهدف الذي هو موضوع الدراسات الحالية.
الكمي للcolocalisation على النحو المبين أعلاه يتطلب إعداد دقيق العينة. وينبغي إيلاء اهتمام خاص لتثبيت العينة ، وعرقلة الفترة والتخفيفات الأضداد. للحصول على أفضل إشارة إلى نسبة الضوضاء ، ينبغي معاير كل الأضداد الابتدائية والثانوية في التجارب الأولية لتحديد تركيزات الأمثل. في تجربتنا ، أنتجت Mowiol المتوسطة المتزايدة أفضل الصور.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتم تمويل هذه الدراسات من قبل ويلكوم ترست والمملكة المتحدة والتهاب السحايا. وقدمت HBMEC خط خلية KS الدكتور كيم. أجريت التصوير مبائر والمجهر الإلكتروني في مرفق Bioimaging ولفسون ، جامعة بريستول. نود أيضا أن نشكر السيد آلان Leard ، الدكتور مارك جيبسون (جامعة بريستول) ، والسيد آلان تيلي (PerkinElmer) لما قدموه من مساعدة والمشورة.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 12 well plate | Corning | BC311 | ||
| Glass Coverslips | VWR | 631-0152 | ||
| BHI AGAR | LAB M | LAB048 | ||
| M199 | Sigma | M2154 | ||
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167E | ||
| MEM Non Essential Aminoacids | Sigma | M7145 | ||
| HANK’S balanced salt solution | Sigma | H9269 | ||
| FBS | Biowhittaker | DE14-801F | ||
| Glutamine | Sigma | G7513 | ||
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | ||
| MEM Vitamin solution | Sigma | M6895 | ||
| PBSB | Lonza | BE17-513F | ||
| BSA | Sigma | A9418 | ||
| Paraformaldehyde | Fisher | P/0840/53 | ||
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | ||
| DAPI | Sigma | D-9564 | ||
| Vectashield | Vector | H-1000 | ||
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | ||
| Anti‑Nm antiserum | Laboratory raised | Rabbit serum | ||
| TRITC anti-rabbit Ig | Sigma | T6778 | ||
| Anti α‑actinin mAb [7H6] | Abcam | Ab32816 | IgG | |
| Anti actin mAb | Sigma | A4700 | IgG2a | |
| Anti vimentin mAb | Sigma | V6630 | IgG1 | |
| ALEXA FLUOR 488 anti‑mouse IgG | Invitrogen | A11001 | ||
| FITC anti-mouse IgG | Sigma | F-2012 |
1. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM):
Leica SP5 confocal imaging system: This system, by using a combination of AOTF (acousto-optical tuneable filter) and an AOBS (acousto-optical beam splitter), simplifies excitation with specific wave lengths.
2-Software:
Leica confocal software LCS, Leica Microsystems, Germany.
Volocity 5, Improvision, PerkinElmer, USA.
References
- Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions. Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).
- Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides. Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).
- Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin. Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).
- Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells. Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).
- Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images. Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).
- Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).
