1. Immunofluorescentie Protocol Zaaien, Infectie & immuno-kleuring De volgende procedures vereisen geschikt veiligheidsniveau weefselkweek en microbiologische laboratoria. DAG 1 A. Bereiding van target cellen voor infectie Zaad HBMECs op 50% confluentie (~ 1.5×10 4 cellen / cm 2) op glas dekglaasjes (16 mm diameter) geplaatst in een 12-well plaat (3,8 cm 2 groeigebied / putje). Groeimedium: RPMI 1640 aangevuld met 15% hitte-geïnactiveerd (56 ° C, 30min) FBS, 2 mM glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, 100 U / ml penicilline / streptomycine, 1% (v / v) MEM niet-essentiële aminozuren zuren oplossing en 1% MEM vitaminen oplossing. Cultuur 's nachts (O / N) bij 37 ° C, in een 5% CO 2 incubator. B. bacteriecultuur Groeien de stam van belang O / N (16-18 uur) op het gewenste medium zoals Brain Heart Infusion (BHI) agar platen aangevuld met 10% verwarmd paard bloed bij 37 ° C in 5% CO 2 atmosfeer 4. DAG 2 A. Bereiding van Bacteriële (N. meningitidis) Suspension Met behulp van een 10 pi cultuur loop, maak een schorsing van de nacht bacteriecultuur in 2 ml PBSB (PBS met calcium en magnesium). Laat grote bacteriële aggregaten om zich te vestigen door het verlaten van de schorsing te staan voor 5 min bij kamertemperatuur (RT). Zonder de pellet te verstoren, overdracht van de top 1 ml van de suspensie (stock inoculum) in een steriele buis. In te schatten hoeveelheid bacteriën in de voorraad inoculum, voeg aliquots (20-50 pi) om buizen die 1 ml volumes van 1% SDS in 0,1 M NaOH toe en meng voorzichtig op te lossen. Meet het nucleïnezuur inhoud van de oplossing door het bepalen van de absorptie bij 260nm (A260). In onze handen, A260 van 1 komt overeen met 5×10 8 kolonievormende eenheden / ml (cfu / ml). Dit kan worden geverifieerd door de voorbereiding van een reeks van verdunningen van de voorraad inoculum in PBSB, plating op agar platen en het tellen van kolonies na O / N incubatie. Verdun een aliquot van de voorraad inoculum in de infectie medium [(M199 aangevuld met 2% decomplemented (56 ° C, 30 min) normaal menselijk serum (NHS)] om de gewenste bacteriële dichtheid voor de infectie van target cellen te verkrijgen. In ons laboratorium is een infectie verhouding van 200-300 bacteriën per doelcel routinematig gebruikt. B. Cel Cultuur Infectie Was de dekglaasjes met gekweekte doelcellen drie keer met medium Hank om eventuele sporen van antibiotica te verwijderen. Cellen infecteren met vers bereide bacteriële suspensies (hierboven beschreven) voor 3 uur tot 8 uur bij 37 ° C, in 5% CO 2. Aan het einde van de infectie periode, wassen cellen drie keer met PBS en in 500 uL van 2% paraformaldehyde (PFA) vast gedurende 30-45 min bij RT of O / N bij 4 ° C. Paraformaldehyde fixatie op de concentratie en de tijd hierboven weergegeven werd geschikt bevonden voor het behoud van bacteriële en cellulaire morfologie. Na het wassen af paraformaldehyde, permeabilise de paraformaldehyde-vaste cellen door incuberen in 0,1% Triton X-100 in PBS verdund gedurende 10 minuten. Was de monsters 3 keer met PBS. Ga verder met immuno-vlekken of, als alternatief, monsters in 500 ul van 1% BSA / PBST O / N 4 vertrekken ° C. DAG 3 Immuno-kleuring Kleuring van intracellulaire bacteriën en α-actinine kunnen opeenvolgend of gelijktijdig worden uitgevoerd door middel van passende primaire en secundaire antilichamen als volgt: alle procedures kunnen worden uitgevoerd in 12-well platen. Blokkeer de dekglaasjes met de permeabilised cellen met 500 pi van 3% BSA / PBST (PBS met 0,05% Triton X-100) voor 30-60 min bij RT Na het wassen met PBS, breng elke dekglaasje naar een nieuwe droge goed in de 12-well plaat. Voeg de primaire antilichamen tegen bacteriën en α-actinine; tachtig tot 100 ul van antistof per dekglaasje is het voldoende als toegevoegd aandachtig naar het oppervlak van het dekglaasje te dekken. Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur. We gebruikten konijn polyklonaal antiserum tegen Neisseria meningitidis (laboratorium-verhoogd) en de muis monoklonaal antilichaam (mAb) tegen α-actinine (Abcam) tegelijk. In sommige experimenten, in plaats van anti α-actinine, waren mAbs tegen actine of vimentine gebruikt (Sigma). Aan het eind van de incubatie, voeg 200 ul PBS naar de bron, tilt u de dekglaasje en leg in een nieuw putje met 500 pi PBS. Na 5 minuten, verwijder PBS door pipetteren en voeg dan verse PBS. Tweemaal herhalen. Overdracht coverslips naar eennieuwe droge goed. Voeg de juiste secundaire antilichamen geconjugeerd aan verschillende fluorochromen verdund in 1% BSA / PBST; incuberen bij KT 1u in het donker. Voor bacteriële detectie, gebruikten we anti-konijn Ig geconjugeerd aan TRITC en voor α-actinine en andere cytoskelet eiwit detectie, gebruikten we anti-muis Ig geconjugeerd om ofwel FITC-(Sigma) of Alexa Fluor 488 – (Invitrogen). Aan het eind van de incubatie, was net als in stap 4 en 5. Teller vlek met 0,6 ug / ml DAPI in PBS (DNA vlek) gedurende 5 min bij RT in het donker. Spoelen met PBS. Mount dekglaasjes (cellen naar beneden gericht) op dia's met een daling van montage medium (e, g Mowiol of Vectashield) Bewaren in het donker bij 4 ° C. Monsters staan klaar voor observatie onder de microscoop. 2. Confocale laser scanning microscopie (CLSM) Observeren en foto's maken van intracellulaire bacteriën en cytoskelet-elementen, gebruikten we immunolabelled samples en vastgelegde beelden met behulp van een Leica SP5-AOBS confocale laser scanning microscoop gekoppeld aan een Leica DM I6000 omgekeerde epifluorescentiemicroscoop. Alle beelden werden verzameld met behulp van een 63x NA 1,4 olie-immersie objectief en proces met Leica software. CLSM procedure: Om te beginnen de CLSM procedure, voeg een druppel immersie olie aan de doelstelling en plaats het monster glijbaan, dekglaasje-kant naar beneden, op de microscoop podium. Stel de microscoop om een visuele modus en vinden op het gebied van belang met het oog stukken van de microscoop. Met behulp van Leica software, kies de xyz overname mode. Selecteer de 512 x 512 formaat (frame formaat). Voor colocalisation studies, de hogere resolutie, hoe nauwkeuriger het beeld, rekening houdend met de resolutie limiet van de microscoop. Selecteer vervolgens de bidirectionele X-modus, die de scansnelheid zal toenemen en bijdragen tot het verminderen foto-bleken. Stel opeenvolgende scaninstellingen. Klik in de "volgende" functie en kies een van de scanmodi. We maken gebruik van 'tussen de lijnen "-modus. Selecteer laserstralen volgens de fluorochromen geconjugeerd aan de secundaire antilichamen: 405 nm voor DAPI (blauw), 488 nm voor Alexa Fluor 488 (groen) en 561 nm voor TRITC (rood). Activeer Fotomultiplicatorbuizen Tube (PMT) 1, 2 en 3, respectievelijk. Pas PMT de instellingen om de juiste emissie golflengte te detecteren. Stel top ('begin') en onderkant ("end") van de z-stacks of serie. Stel vervolgens de gewenste "z-step size". Neisseria meningitidis is een diplokokken (figuur 1G), en aangezien iedere kokken heeft een geschatte diameter van 0,5 micrometer, de z-stapgrootte van 0,20 um werd gekozen om de waarschijnlijkheid van het scannen van elk coccus minstens twee keer te verbeteren. Het is ook binnen de stapgrootte voor een optimale resolutie van 0,1 – 0,2 micrometer. Stel de uiteindelijke scan parameters door het selecteren van lijn gemiddelde van 3 tot en met de signaal-ruisverhouding te verbeteren. Door te klikken op "start" dubbel-of triple-gekleurde beelden worden verkregen door opeenvolgende scannen met verschillende golflengten om overspraak tussen verschillende chromoforen te elimineren. Voor een indicatie van colocalisation van twee fluorochromen, selecteert u de "overlay"-functie om de geselecteerde kanalen samen te voegen tot een enkel beeld, bijvoorbeeld als beide Alexa 488 (groen) en TRITC (rood) fluorochromen colocalise, gele kleur wordt weergegeven in de afbeelding bedekt . Compile z-stacks of series met behulp van de "maximale projectie"-functie voor de bouw van een 2D-afbeelding die nodig is voor het visualiseren van mogelijke colocalisation. Meer gedetailleerde analyse van colocalisation kan worden verkregen door analyse van elk optische gedeelte. Na de overname van de z-stacks of reeks, het verwerken van uw gegevens naar een orthogonale afbeelding voor een visualisatie van intracellulaire lokalisatie van de verschillende elementen (figuur 1E) te verkrijgen. 3. Kwantificering van Colocalisation Statistische analyses van de confocale scanning microscoop beelden zijn uitgevoerd met Volocity software (Improvisation, PerkinElmer). Deze software biedt een hulpmiddel dat specifiek is ontworpen voor colocalisation analyse zoals beschreven door Manders et al.. (1993) 5. Colocalisation in het kader van de digitale fluorescentie beeldvorming kan worden omschreven als de detectie van een signaal op dezelfde voxel (pixel volume) locatie in elk kanaal. De twee kanalen zijn samengesteld uit beelden van twee verschillende fluorochromen uit hetzelfde monster gebied (Volocity handleiding). Statistische analyses zijn uitgevoerd met Volocity software (Improvisation, PerkinElmer) met behulp van kwantitatieve analyse Colocalisation hieronder beschreven. Kwantitatieve analyse Colocalisation Maak een bibliotheek met CLSM beelden met behulp van Volocity software. Selecteer "uitgebreide focus" van beeld in de bovenste balk. Deze tool zal compileren z-stacks in een 2D-afbeelding te analyseren. Selecteer "Colocalization" tool. De twee kanalen te analyseren moeten dezelfde kleurdiepte. Selecteer het gebied dat het gaat worden gekwantificeerd. Stel de drempel om een achtergrond te verwijderen. Maak de colocalisation worden weergegeven door "het genereren van colocalization". Colocalisation statistieken worden gegenereerd voor de gebieden van belang vooraf geselecteerd. Selecteer Manders 'coëfficiënten R (overlap coëfficiënt) en Mijn (colocalisation coëfficiënt). Manders 'coëfficiënten zijn niet gevoelig voor de intensiteit van de vlekken zoals ze zijn genormaliseerd tegen totaal aantal pixels intensiteit; waardoor ze kunnen worden ingezet wanneer de kleuring van een antigeen is sterker dan de andere. Overlap coëfficiënt R volgens Manders 5,6 vertegenwoordigt de ware mate van colocalisation, dwz het aantal pixels dat colocalise in vergelijking met het totaal aantal pixels. Aan de andere kant, de colocalisation coëfficiënt, My, de fluorescentie bijdrage van de meer overvloedige groep (in dit geval α-actinine, groen) om de minder overvloedig groep (in dit geval bacteriën, rood) beschrijft, dat wil zeggen het aantal rode pixels die overlappen met groene pixels in vergelijking met het totaal aantal rode pixels. Manders 'coëfficiënten variëren tussen 1 en 0, waarbij 1 een hoge colocalisation, 0 is niet, maar ze kunnen worden uitgedrukt als een percentage voor eenvoudiger interpretatie. Export-statistieken waarden naar een Excel-document voor de presentatie van gegevens. 4. Representatieve resultaten Intracellulaire lokalisatie van OPC-expressie Neisseria meningitidis en α-actinine Confocale beeldvorming van het menselijk brein microvasculaire endotheelcellen geïnfecteerd zijn met Nm voor de 3 en 8 uur zoals hierboven beschreven is aangegeven colocalisation van α-actinine en Nm die kennelijk minder frequent worden in 3 uur infectie experimenten (niet afgebeeld) in vergelijking met culturen besmet voor 8 uur ( Figuur 1 AF). Een aantoonbare colocalisation van α-actinine met OPC-expressie meningokokken werd waargenomen iedere keer in> 5 repliceren experimenten. Statistische analyse van het gebruik van meerdere colocalisation confocale beelden werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Over het geheel genomen in HBMEC die besmet zijn met OPC-uitdrukken meningokokken,> 25% overlap van de groene (α-actinine) en rood (Nm) pixels werd verkregen (Figuur 2B, Overlap coëfficiënt R). In tegenstelling tot α-actinine, experimenten waarbij de etikettering van geïnternaliseerde bacteriën en ofwel actine-of vimentine werd uitgevoerd, werd af en toe colocalisation waargenomen met actine, maar dat met vimentine was zeldzaam (Figure. 2B). De gegevens werden ook geanalyseerd met behulp van de coëfficiënt My, die rekening houdt met de relatieve rijkdom van elk deel. Mijn is een maat voor de frequentie van voorkomen van de meer overvloedige signaal (in dit geval groen, α-actinine) elke keer dat de minder overvloedig signaal (in dit geval rood, bacteriën) optreedt. Deze maatregel toont een opvallende mate van voorkomen van α-actinine in de buurt van geïnternaliseerde meningokokken (Figuur 2A en C). Figuur 1. Confocale laser scanning microscopie tot intracellulaire interacties van N. te beoordelen meningitidis met α-actinine. AH. Confluente endotheliale monolagen geteeld op dekglaasjes werden geïnfecteerd met de OPC-expressie (AF) N. meningitidis. Na 8 uur, niet-hechtende bacteriën werden afgewassen, cellen gefixeerd met paraformaldehyde en permeabilised met 0,1% Triton X-100. Vervolgens werden bacteriën en α-actinine gekleurd zoals hierboven beschreven (α-actinine, groen, bacteriën, rood). AC. Een veld met xy beelden van de locatie van de Nm (A) of α-actinine (B). De overlay-afbeelding in (C) geeft een aantal regio's waarin geel-oranje kleur verschijnt suggereert colocalisation. Pijlen in (A) en (B) tonen aan regio's waar een hoge mate van α-actinine accumulatie lijkt te hebben plaatsgevonden rond bacteriën. D. Optische dissectie van een geïnfecteerde HBMEC monolaag aangeeft colocalisation rond intracellulaire bacteriën gelegen aan de voet van een cel. Nogmaals, dit colocalisation is niet het gevolg van toevallige nabijheid van α-actinine, als de generaal van α-actinine vlek in dit gebied is laag. E en F. Drie-dimensionale beelden van de besmette HBMEC monolagen verwerkt zoals hierboven. Een schuin oog op de apicale oppervlak (E) toont aanhanger bacteriën gekleurd rood (rode pijl), terwijl een aantal bacteriën zich naar de basale oppervlak van endotheelcellen (gele pijl) zijn duidelijk oranje / geel van kleur. Basale locatie kan meer duidelijk te zien in (F), die een einde-on XZ doorsnede. G. Een negatief gekleurde elektronenmicroscoop beeld van N. meningitidis met haaroverheersende diplococcal uit. Elke coccus is ongeveer 0,5 micrometer in diameter. Figuur 2. Lokalisatie en distributie van α-actinine, actine en vimentine in HBMEC cellen. A. Geïnfecteerde monolagen van HBMEC werden behandeld als beschreven in de legende hierboven, maar in aanvulling op α-actinine, sommige dekglaasjes werden gebruikt voor de detectie van actine of vimentine naar procedure vergelijkbaar met die van α-actinine. Zoals hierboven, α-actinine geconcentreerd rond een aantal geïnternaliseerd bacteriën (witte pijlen). Vimentin en actine niet colocalise met bacteriën, merkbaar niveaus. Bar vertegenwoordigt 20 urn. B. & C. De waarden voor de coëfficiënten R en My werden verkregen van meer dan drie experimenten met Volocity software zoals hierboven beschreven.
