우리는 두뇌 섹션 sectioning 마우스, 제거 및 sectioning 뇌뿐만 아니라, immunoperoxidase의 얼룩, 수지 포함하고, ultrathin의 transcardiac 재관류에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 절차가 완료되면 immunostained 자료 전송 전자 현미경과 함께 시험에 대한 준비가되었습니다.
Abstract
전송 전자 현미경 (TEM)은에서 중추 신경계에 microglial, oligodendrocytic astrocytic와의 연결을 subcellular 구획 (dendrite, 돌기 척추, 축삭, 축삭 터미널, perikaryon),뿐만 아니라 자신의 세포 organelles과 cytoskeleton을 시각화를위한 매우 유용합니다 높은 공간 해상도. 로 표시, TEM과 결합하여, 사전 퍼가기의 immunocytochemistry는 몇 가지 독특한 기능과 식별 기준 (예, microglial perikarya 및 프로세스, microglia 특정 마커 Iba1 (이온화 칼슘 바인딩 어댑터 분자 하나에 대한 항체를 사용하는 경우와 세포 요소의 차별을 허용 여기에)), 신경 전달 물질의 세포 요소의 내용 (예 : serotonergic) 및 ultrastructural 가용성이나 멤브레인 – 바운드 단백질의 지방화 (예 : 5 HT1A 및 EphA4 수용체)를 식별. 여기, 우리는 acrolein 정착액, 뇌 섹션의 sectioning 제거 및 sectioning 뇌뿐만 아니라 immunoperoxidase – diaminobenzidine (DAB) 얼룩, 수지 포함하고, ultrathin와 생쥐의 transcardiac 재관류에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 절차가 완료되면 immunostained 자료 TEM과 시험 준비가되었습니다. 엄격하게 수행하는 경우,이 기술은 최적의 ultrastructural 보존과 immunocytochemical 검출 사이 좋은 타협을 제공합니다.
Protocol
1. 동물 재관류 재관류 전날에 준비 : – 인산염 버퍼 2 패 (PB, 100 MM, 산도 7.4) 및 나트륨 1 L 인산염 버퍼 호수 (PBS를, 0.9 % 50 MM PB에 NaCl, 산도 7.4)을 두 번 증류수 인치 4 PB의 PBS와 1L ° C.를 저장 이들은 재관류 및 사전 삽입의 immunocytochemistry에 사용됩니다. – 6 생쥐의 재관류를 가능하게 4.0 %의 paraformaldehyde의 1L (PFA, 산도 7.4) 정착액 솔루션. 그 목적을 위해, 가열 퓸 후드 아래에 PB 1 패 ?…
Discussion
여기 우리는 최적의 ultrastructural 보존 및 절차 엄격하게 수행됩니다 immunocytochemical 감지, 사이 좋은 타협을 제공 immunoelectron 현미경에 대한 마우스 뇌 조직의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다.
TEM과 결합,이 방법은 몇 가지 독특한 기능과 식별 기준으로 세포 요소를 구분할 수 있습니다. 특히, Iba1의 immunoperoxidase – DAB의 얼룩은 neuropil 내에 microglial perikarya 및 프로세스를 식별…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 기술 지원을 위해 로체스터 의료 센터의 대학의 전자 현미경 연구의 핵심 시설에 연동 펌프와 vibratome의 사용뿐만 아니라, 카렌 L. 벤틀리와 게일 슈나이더에 대한 Shao – 명나라 루 해리스 A. Gelbard 감사합니다. 이 작품은 NIH (EY019277), 화이트홀 재단, 버로우즈 웰컴 기금과 AKM에 알프레드 P. 슬로안 재단의 기금에 의해 투자되었다. M.-È.T. 퐁 드 라 공들인 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ) 박사 교육 수상에 의해 후원됩니다.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Sodium pentobarbital (Nembutal)
Ovation Pharmaceuticals
Filter paper 315 24 cm
VWR
28331-081
*Acrolein purum (≥95%)
Sigma-Aldrich (Fluka)
01680
Sodium borohydride (≥98%)
Sigma-Aldrich (Aldrich)
452173
*Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%)
Sigma-Aldrich
441244
Normal goat serum
Jackson ImmunoResearch
005-000-121
Rabbit anti-Iba1 primary antibody
Wako
019-19741
Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific
Jackson ImmunoResearch
111-066-046
Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
Peroxidase-conjugated streptavidin
Jackson ImmunoResearch
016-030-084
Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
*Osmium tetroxide 4% solution
Electron Microscopy Sciences
19150
Light sensitive
Propylene oxide (≥99%)
Sigma-Aldrich (Fluka)
82325
Polypropylene disposable beakers (50 mL)
Fisher
01-291-10
Aluminium weigh dishes (70 mm)
Fisher
NC9261784
Durcupan epoxy resin
Electron Microscopy Sciences
14040
Embedding mold
Electron Microscopy Sciences
70907
DPX mountant for histology
Sigma-Aldrich (BioChemika)
44581
Gelatin subbed slides
VWR
100241-864
ACLAR embedding films (7.8 mm)
Electron Microscopy Sciences
50425
Capsule mold
Electron microscopy Sciences
70150
High-performance super glue
Corporate Express
LOC30379
Perfect loop for ultra thin sections
Electron Microscopy Sciences
70944
Superfrost slides
Fisher
22-178-277
Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm)
Diatome
Gelatin from cold water fish skin (~45%)
Sigma-Aldrich (Sigma)
G7765
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.
Tremblay, M., Riad, M., Majewska, A. Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy. J. Vis. Exp. (41), e2021, doi:10.3791/2021 (2010).