Summary

免疫電子顕微鏡のためのマウスの脳組織の準備

Published: July 20, 2010
doi:

Summary

我々は経心臓的マウスの灌流、脳の除去と切片だけでなく、免疫ペルオキシダーゼ染色、樹脂の埋め込み、および脳切片の切片極薄のためのプロトコルについて説明します。これらの手順が完了すると、免疫染色の材料は、透過型電子顕微鏡による検査のための準備ができています。

Abstract

透過型電子顕微鏡(TEM)がで中枢神経系では、非常に、ミクログリア可視化に有用なオリゴデンドロサイト、アストロサイト、神経細胞内コンパートメント(樹状突起、樹状突起スパイン、軸索、軸索ターミナル、周核体)、ならびにそれらの細胞内小器官と細胞骨格です。高空間分解能。として提示さ、TEMと組み合わせることで、事前に埋め込み免疫細胞は、いくつかの特徴と識別基準(例えば、ミクログリアperikaryonの複数形やプロセス、ミクログリア特異的なマーカーIba1(イオン化カルシウム結合アダプター分子1に対して抗体を使用しているときに携帯電話の要素の識別を可能にここで))、神経伝達物質の細胞内要素の内容(例えば、セロトニン作動性)およびそれらの超微細構造の可溶性または膜結合タンパク質の局在化(例えば、5 HT1AおよびEphA4の受容体を)特定する。ここでは、アクロレイン固定液、脳の除去と切片だけでなく、免疫ペルオキシダーゼ – ジアミノベンジジン(DAB)染色、樹脂の埋め込み、および脳切片の切片極薄でマウスの経心臓的灌流のためのプロトコルについて説明します。これらの手順が完了すると、免疫染色の材料はTEMで試験の準備ができています。厳密に実行する場合は、この手法は、最適な微細構造の保全と免疫細胞化学的検出の間で優れた妥協点を提供します。

Protocol

1。動物の血流灌流の前日に、準備します。 とナトリウムリン酸緩衝液(PBS、50mMのPBで0.9%のNaCl、pH7.4)を生理食塩水を1Lの蒸留水に、 – リン酸緩衝液(100mMの、pH7.4のPB)の2 L。 4でPBのPBSと1L℃にて保存してください。これらは血流との事前エンベディング免疫細胞化学のために使用されます。 – 6匹のマウスの灌流を可能とする4.0%のパラホルムアルデヒド(PFA、pH7.4)で固…

Discussion

ここでは手続きが厳格に実行されるときに、最適な超微細構造の保全と免疫細胞化学的検出の間で優れた妥協点を提供する免疫電子顕微鏡のためのマウスの脳組織の準備のためのプロトコルを記述している。

TEMと組み合わせることで、この方法はいくつかの特徴と識別基準に携帯電話の要素を区別することができます。特に、Iba1の免疫ペルオキシダーゼ- DAB染色では神?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は技術支援のためのロチェスター大学医療センターの電子顕微鏡研究の中核施設で、蠕動ポンプとビブラトームの使用だけでなく、カレンL. Bentleyとゲイルシュナイダーのために少明陸とハリスA. Gelbardに感謝。この作品は、NIH(EY019277)、ホワイトホール財団、バローズウェルカム基金、及びAKMのアルフレッドP.スローン財団からの補助金によって賄われていた。 M.-È.T.フォンデラ凝ったエンサンテケベック(FRSQ)ポスドクトレーニングの賞によって運営されている。

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Sodium pentobarbital (Nembutal)   Ovation Pharmaceuticals    
Filter paper 315 24 cm   VWR 28331-081  
*Acrolein purum (≥95%)   Sigma-Aldrich (Fluka) 01680  
Sodium borohydride (≥98%)   Sigma-Aldrich (Aldrich) 452173  
*Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%)   Sigma-Aldrich 441244  
Normal goat serum   Jackson ImmunoResearch 005-000-121  
Rabbit anti-Iba1 primary antibody   Wako 019-19741 Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific   Jackson ImmunoResearch 111-066-046 Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
Peroxidase-conjugated streptavidin   Jackson ImmunoResearch 016-030-084 Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
*Osmium tetroxide 4% solution   Electron Microscopy Sciences 19150 Light sensitive
Propylene oxide (≥99%)   Sigma-Aldrich (Fluka) 82325  
Polypropylene disposable beakers (50 mL)   Fisher 01-291-10  
Aluminium weigh dishes (70 mm)   Fisher NC9261784  
Durcupan epoxy resin   Electron Microscopy Sciences 14040  
Embedding mold   Electron Microscopy Sciences 70907  
DPX mountant for histology   Sigma-Aldrich (BioChemika) 44581  
Gelatin subbed slides   VWR 100241-864  
ACLAR embedding films (7.8 mm)   Electron Microscopy Sciences 50425  
Capsule mold   Electron microscopy Sciences 70150  
High-performance super glue   Corporate Express LOC30379  
Perfect loop for ultra thin sections   Electron Microscopy Sciences 70944  
Superfrost slides   Fisher 22-178-277  
Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm)   Diatome    
Gelatin from cold water fish skin (~45%)   Sigma-Aldrich (Sigma) G7765  

*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.

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Cite This Article
Tremblay, M., Riad, M., Majewska, A. Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy. J. Vis. Exp. (41), e2021, doi:10.3791/2021 (2010).

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