МИССИЯ esiRNA для скрининга RNAi в клетках млекопитающих

1. Высококачественные библиотеки МИССИЯ esiRNA Для каждого гена наиболее восприимчивы и конкретным целевым регионом для RNAi выбирается использованием DEQOR алгоритм (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html) 4. DEQOR оценки глушителей потенциал всех возможно 21 нуклеотидов siRNAs в целевой мРНК основана на состоянии искусства дизайн-ограничений 4. Кроме того, каждый потенциальный миРНК анализируется для возможного перекрестной реактивности с другими генами, выполняя BLAST поиска по транскриптома организма изучены. Программы таким образом, обеспечивает анализ общего качества и кросс-глушителей возможностей потенциальных esiRNA (300-600 б.п. длины). Выбранной области целевого гена кДНК усиливается ПЦР с использованием генов-специфических праймеров окружении бактериофага РНК-полимеразы-промоутер последовательностей. Каждый продукт ПЦР используется для производства МИССИЯ esiRNA проверяется на идентичность с помощью секвенирования и для чистоты анализа суппорт Labchip. Длинные двухцепочечной РНК транскрибируется с ПЦР-продукт РНК-полимеразы с последующим отжигом транскрибируется прядей. esiRNAs готовят ограниченную ферментативного переваривания долго двухцепочечной РНК с использованием RNaseIII с последующей очисткой через анионообменной хроматографии использованием Q-сефарозе столбцов спина. esiRNAs осаждаются и ресуспендировали в буфере TE. Доходность измеряется УФ-поглощения измерения и концентрация регулируется путем растворения в соответствующем объеме буфера ТЕ. Общее качество конечного продукта проверяется анализом суппорт Labchip. 2. Выбор линии клеток и оптимизация трансфекции для скрининга Титруйте количество esiRNA (использование Eg5 как положительные и renilla-люциферазы в качестве отрицательного контроля) и увеличением количества трансфекции реагента в 384-луночного планшета, добавьте клеток и инкубировать в течение 48 часов. Eg5 является белком кинезин двигателя, необходимых для сборки биполярного веретена и истощение приводит к митотический арест. Повторите эту процедуру для различных реагентов трансфекции и клеточных линиях. Здесь мы используем HeLa клеток, культивированных следующие стандартные процедуры и oligofectamine (Invitrogen) в качестве реагентов трансфекции. Для того чтобы выбрать оптимальные условия трансфекции подсчет клеток, трансфицированных Eg5 esiRNAs, которые показывают, митотический арест (круглой формы), а общее число клеток, трансфицированных renilla-люциферазы (RLUC) esiRNA с помощью световой микроскопии. Выберите состояние с наименьшей токсичностью для RLUC и наиболее выражены фенотип для Eg5. Альтернативный метод для оптимизации условий трансфекции предполагает стабильную клеточную линию выражения EGFP (или другой подходящий ген репортер) под контролем учредительных активным пропагандистом. После трансфекции esiRNA против EGFP (или другой ген-репортер) и RLUC (или другой подходящий отрицательный esiRNA контроль) мера нокдауна эффективности и токсичности, например, путем флуоресценции помощью сортировки ячейки (FACS). Убедитесь, что использовали esiRNA для EGFP полностью дополняют целевой мРНК. 3. Настройка основного экрана 5,6 Оптимизация пипетирования точности для всех используемых компонентов на автоматической станции пипетки (например, Водолей, Tecan и WellMate, Matrix). Потому что пипетирования параметры изменяются в зависимости от типа решение типа, объема и пластины этой оптимизации должен быть повторен для каждого шага в отдельности. Если это возможно, пипетки станции должен быть помещен под капотом ламинарного потока, чтобы избежать загрязнения. Все используемые компоненты следует продезинфицировать, прежде чем использовать либо в автоклаве при необходимости или путем распыления с 75% этанола. Оптимизация мыть-протоколов, так что перекрестное загрязнение от колодца к колодцу, не допускается. Подробная информация для оптимизации автоматизированных пипетки не может дать для космических ограничений и в значительной степени зависят от используемых пипетирования станции. За более подробной информацией обратитесь к протоколу производств. Трансфекции клеток в 384-и формат, используя оптимизированные условия сверху esiRNAs для Eg5 и RLUC. Используйте чередуются для Eg5 и RLUC esiRNA охватывающих всю тарелку. После инкубации в течение 48 часов зафиксировать клетки с холодными 100% этанол, увлажняет в PBS в течение 15 минут, пятно в течение 25 минут в PBS, содержащем 1 мкг / мл DAPI и 100 мкг / мл РНКазы (Qiagen). Наконец промыть PBS и хранить при температуре 4 ° C. Мера интенсивности DAPI-флуоресценции с помощью микроскопа, например, на системы Olympus ScanR. Создание гистограммы, откладывая DAPI интенсивности от числа клеток и оценить распределение клеточного цикла, вычисляя процент клеток с ДНК-контента 2N для G1-фазе; <2> 4N для S-фазы; 4N для G2/M-phase и > 4N для анеуплоидии / полиплоидии. Оценка однородности результатов за тарелку. Дальнейшая оптимизация необходима, если результаты будут отличаться значительно, чтобы исключить положение Эффекарата. Общей проблемой при использовании мульти-луночных усиливается испарение на краю скважин во время инкубационного периода. Это приводит к различным условиям эксперимента в разных скважин, которые часто переводится как пластинчатые позиции специфических эффектов. По этой причине, мы рекомендуем оставить все края скважин пустой экран. Для дальнейшей минимизации испарения убедитесь, что инкубаторы хранятся при высокой влажности. Мы также регулярно используют испарение барьеры, такие как Corning Дышащие уплотнительная лента, которые блокируют испарение. Кроме того, другие ресурсы для эффекта положения должны быть приняты во внимание, например, технические изменения системы отсчета (микроскоп, ридер и т.д.) или разновидности наливных (градиенты, неоднородность решений и т.д.). Статистические различия между положительными и отрицательными управления обеспечивают меру значение анализа занятых. Большая разница между отрицательного контроля (или фоновый шум, макет-контроль) и образца должна быть установлена ​​до начала фактической проверки. Хорошая мера для статистической значимости Z-фактор. Z-фактор рассчитывается следующим уравнением: Z = 1 – (3 SD [образец] + 3 SD [макет]) * (| Av [образец] – Av [макет] |) -1; с SD: стандартное отклонение; Av: средняя. Z-фактора 1> Z> 0,5 указывает на статистически значимое разделение отрицательного контроля (и шум) из положительного контроля 7. 4. Первичный экран Подготовка 384-луночных культуры тканей для трансфекции esiRNAs использованием оптимизированных условиях сверху. Здесь мы используем 15ng esiRNA в хорошо растворяется в 5 мкл буфера ТЕ. По меньшей мере восемь контроль позиций в пластине должен быть загружен с подходящими положительные и отрицательные контроли для биологических процессов изучена (здесь: Eg5 и RLUC). Чтобы избежать эффекта положение края скважины загружаются с 5 мкл ТЕ буфера только. Добавить 5 мкл OptiMEM (Invitrogen), содержащий 0.2μl Oligofectamine на лунку, перемешать и инкубировать 20 минут при комнатной температуре. Добавить клеточной суспензии на трансфекции смеси (здесь: 40μl суспензии HeLa ячейки на 25 кл / мкл концентрации; эквивалентную до 1000 клеток на лунку) и инкубировать в течение 72 часов. Мера ДНК-контент на автоматизированных микроскоп (Olympus ScanR, см. выше). Оценка использования Z-оценка Статистика хит выбор: Z-оценки рассчитываются для всех образцов esiRNAs использованием сигнала для отрицательного контроля в качестве справочных. Обратите внимание, что Z-оценка не совпадает с Z-фактор. Z-оценки обеспечивают статистический показатель на значимость выборочных значений по сравнению с (макет) контроля. Он рассчитывается следующим уравнением: Z = (значение [Образец] – средняя [макет]) * стандартное отклонение [макет] -1. Для выбора хит порог должен быть применен. Как правило, значения критериев, как: 2 <Z <-2 используется, но в зависимости от качества данных, изучал биологический процесс, или просто сферу экран, различные пороговые значения могут быть применимы. Помимо довольно легко Z-оценка статистика также более сложные математические методы оценки могут быть использованы (сначала внутри в широком поле статистической оценки отбора данных можно найти в Malo и соавт. 8). 5. Вторичный экран и нажмите проверки Дополнительный экран следует основной экран для исключения ложных срабатываний из-за погрешностей эксперимента или вне целевой эффекты. Для выбранного хитов же процедуру, что используются в основной экран должен быть повторен для большего количества дубликатов (3-5), чтобы лучше статистической оценки. Для проверено хитов вторичных неперекрывающихся esiRNA (или другой неперекрывающихся глушителей триггер) против цели, определенные в начальной экраны должны быть использованы. Же анализ и считывания должна применяться как для основного экрана. В конечном счете выбранных генов может быть проверена межвидовой RNAi спасения 9. Таким образом бактериальные искусственные хромосомы (BAC) кодирования, например, мыши ортолога ген стабильно трансфицированных в клетки. BAC-конструкты сохранить геном в его геномной контекста и позволяют почти-физиологическое выражение. RNAi против эндогенного гена человека оставят выражение мыши трансгенов неизменным, которая спасает RNAi-фенотипа. RNAi-спасательных обеспечивает золотым стандартом для проверки фенотипы RNAi доступных на сегодняшний день. Наконец, проверку кандидатов изучаются более подробно, чтобы в конечном итоге получить механистического понимания. Во многих случаях RNAi могут быть использованы в этих экспериментах, например, в средних, более сложные анализы.