Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA
Summary
Burada bir insan esiRNA kütüphane ilgili genler hücre bölünmesi için yüksek verimli bir ekran kullanın. Biz nasıl bir esiRNA ekranlarının yanı sıra, sonuçları nasıl analiz etmek ve doğrulamak için kurmak ve yürütmek göstermektedir.
Abstract
RNA enterferans (RNAi) gen ekspresyonunun kontrolü için temel bir hücresel mekanizmadır. RNAi küçük müdahale RNA'lar (siRNA) olarak da bilinen kısa çift iplikçikli RNA'lar tarafından indüklenir. Kısa çift iplikçikli RNA'lar Dicer, endonükleazları RNaz III ailesinin bir protein aktivitesini daha uzun çift zincirli öncüleri kaynaklanır. Çıkan parçaları cognate hedef mRNA yönetmenlik, RNA-indüklenmiş susturulması kompleksi (RISC) bileşenleridir. RISC böylece kodlanmış protein 1,2,3 ifade azaltılması hedef mRNA parçalayarak. RNAi küçük müdahale RNA'lar kullanan memeli hücrelerinde gen fonksiyon testleri kaybı için güçlü ve yaygın olarak kullanılan deneysel bir yöntem haline gelmiştir.
Şu anda küçük müdahale RNA'lar üretimi için iki ana yöntem mevcuttur. Bir yöntem, alternatif bir yöntem in vitro RNaz III hedef özgü uzun çift iplikçikli RNA'lar endonucleolytic bölünme istihdam ise kimyasal sentez içerir. Böylece, siRNA-benzeri çeşitli bir havuz oligonükleotidler endoribonuclease hazırlanmış siRNA veya esiRNA olarak da bilinir üretilir. Kimyasal olarak elde edilen siRNA'lar ve esiRNAs etkinliğinin karşılaştırılması, her iki tetikler hedef gen susturulması güçlü olduğunu gösterir. Özgüllüğü karşılaştırarak zaman Farklılıklar, ancak tanık olabilir. Birçok tek kimyasal olarak sentezlenmiş siRNA'lar esiRNAs doğasında karışım daha spesifik bir demonte 10 yol açar ise, önde gelen off-hedef efektler üretir.
Bu çalışmada, genom-ölçekli MİSYON esiRNA kütüphaneleri ve hücre döngüsünün ilerlemesi alan genlerin belirlenmesi için DNA içeriği ekran örneklediği RNAi tarama için kullanımı tasarım mevcut. Biz transfeksiyon protokolü ve yüksek verimlilik tarama testinin nasıl optimize göstermektedir. Biz de istatistiksel olarak değerlendirildi, ne kadar büyük olabilir veri setlerini göstermek ve birincil hit doğrulamak için yöntemler mevcut. Son olarak, valide vurur daha fazla fonksiyonel nitelendirmeler için potansiyel başlangıç noktalarını verir.
Protocol
Discussion
RNA girişim-fonksiyon kaybı fenotipleri incelemek için standart bir teknik haline gelmiştir. RNAi mediatörlerin Büyük ölçekli koleksiyonları farklı tedarikçilerden mevcuttur ve gen susturulması için kolay, maliyet-etkin ve hızlı bir yöntem sağlamak. Bu farklı türler ve hücre türleri geniş bir yelpazede bir genom ölçekli bir bakış açısı sağlayan birçok biyolojik süreçlerde anahtar oyuncular için sistematik tarama için kapı açtı.
Yüksek yanlış pozitif ve yanlış negatif oranları RNAi ekranlarında ortak bir meydan okuma. Bu sorunu çözmek için, etkinliğini artırmak için önemli çabalar yatırım ve özellikle de sessizliğini özgüllüğü tetikler edilmiştir. Önemli bir keşif aynı transkript hedefleyen farklı siRNA'lar bir havuz hedef özgüllüğü büyük ölçüde artırdığını oldu. Çok karmaşık, farklı siRNA'lar bir havuz endoribonuclease tarafından üretilen olduğundan, esiRNAs RNAi ekranlarında yalancı pozitiflik oranı azaltmak, yüksek hedef özgüllüğü tetikler. esiRNAs aynı zamanda da yanlış negatif oranının azaltılması, etkili knockdowns ulaşmak için göstermiştir.
RNAi ekranları teknik olarak zor olduğundan, muhtemelen bir süre için bir rutin olarak gerçekleştirmek zor kalacaktır. Ancak, reaktifler ve araçlar daha iyi ve daha laboratuvarlar kendi uzmanlık pay almak, modern biyolojinin RNAi ekranların kullanımı gelecekte artırmak için kabul edilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz tartışma için Buchholz laboratuar ve Sigma-Aldrich RNAi ekibi üyeleri kabul etmek istiyorum. Max-Planck-Society ve Bundesministerium für Bildung und Forschung grands destek için [0315105]-Bio teşekkür etmek istiyorum.
MİSYON ® Sigma-Aldrich Biyoteknoloji LP tescilli markasıdır.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comments |
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | ||
| Wellmate | ThermoScientific | |||
| Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | ||
| OptiMEM | Invitrogen | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder | |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).
- Jackson, A. L. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Echeverri, C. J. Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens. Nat Methods. 3, 777-779 (2006).
- Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).
- Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. Systems biology of mammalian cell division. Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).
- Kittler, R. Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells. Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).
- Kittler, R. RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).
- Kittler, R. Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nat Methods. 4, 337-344 (2007).
