Cryotomography elettrone di cellule batteriche

I. Preparazione della Cultura cellula batterica Crescere le cellule batteriche nei loro media normale fase desiderata in una cultura in pochi ml di liquido. Se una maggiore concentrazione è necessaria, la filatura e la risospensione in mezzi freschi possono essere adottati, ma essere consapevoli che questo processo introduce a volte modifiche strutturali nelle cellule. Controllare al microscopio ottico per assicurarsi che la cultura è privo di contaminanti e ad una confluenza appropriato. Alcune cellule batteriche possono aderire o addirittura crescere sulle griglie EM. Quando le cellule crescono sulle griglie, griglie d'oro con uno strato di carbonio sono più spesso utilizzati per evitare la tossicità per le cellule. Dovrebbero essere dimessi bagliore per 2 minuti, sterilizzato sotto una luce UV per 15 minuti, e posizionati direttamente nella cultura liquido. Cellule aderenti, naturalmente, bastone alla rete, e altri possono essere richiesto di aderire alla rete di rivestimento della griglia di 0,1% di poli-L-lisina per primo. Controllare le griglie al microscopio prima luce per assicurarsi che la concentrazione di cellule è opportuno prima del congelamento. II. Plunge cellule congelamento sottile Per sottile cellule batteriche, la sospensione di cellule intatte è tuffo congelato attraverso una griglia di EM. Il processo conserva l'ultra-struttura delle cellule dei batteri e impedisce l'evaporazione dell'acqua in alto vuoto di EM più tardi. Può essere effettuato sia con dispositivi tuffo su misura di congelamento, o come mostriamo qui, con un congelatore commerciale tuffo automatico, FEI Vitrobot MKIII 4. Scarica luminescente la griglia di carbonio rivestiti EM per 2 – 4 minuti. Questo rende la superficie della griglia idrofilo, contribuendo così a diffondere uniformemente il campione lungo l'intera griglia. Mescolare 100μl soluzione colloidale oro (diametro delle particelle di 10 nm) con 25μl di una soluzione concentrata al 5% BSA. I cappotti BSA le particelle d'oro e questo impedisce loro aggregazione. Centrifugare la BSA e la miscela di particelle d'oro al 18000g per 15 minuti. Dopo aver rimosso il supernatante, il restante oro pellet viene miscelato con soluzione di 20 microlitri di cellule. Il trattato particelle d'oro BSA non reagiscono con le cellule, ma saranno necessari come marker fiduciali per la ricostruzione delle tomografie. Applicare 4 l di cella e la soluzione miscela d'oro per il bagliore dimesso griglia EM nel Vitrobot al 100% di umidità. La griglia viene automaticamente cancellato da entrambi i lati con Nr. 1 carta da filtro. Ciò elimina il liquido in eccesso, in modo che solo un sottile strato di cellule nel loro media rimane. La griglia viene poi immersa rapidamente in una miscela liquida di etano e propano che viene raffreddato a circa 77K con azoto liquido. Durante questo processo, il campione è congelato così rapidamente che la formazione di cristalli di ghiaccio è impedito a film sottili <1 micron. Rimuovere con cautela la griglia dal etano / propano miscela e velocemente trasferire in un contenitore griglia che viene tenuto sotto azoto liquido. III. Pressione alta e congelamento Cryo Sezionamento di spessa Cellule Per le cellule più spesse, il congelamento ad alta pressione riduce la cristallizzazione di ghiaccio e il successivo sezionamento crio rende campioni abbastanza sottile per EM imaging. 5, 6, 7 Ci sono molti portacampioni differenti disponibili per il congelamento ad alta pressione, la selezione dipende dal campione, il tipo di congelamento della macchina usata o l'applicazione investigativo selezionata. Qui usiamo Bal-Tec HPM 010 congelatore ad alta pressione e crio ultra microtomo modello UC6/FC6 di Leica Microsystems. Per i batteri, 15ml filatore cultura OD> 0,5 è presa direttamente dal 37 ° C incubatore e centrifugati a 1000rpm per 3 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, 0,5 ml mix di cultura pellet residuo con 0,5 ml di 20% crioprotettore destrano e poi centrifugare a 13000rpm per 15 secondi. Dopo aver rimosso il surnatante, 0,1 ml pipetta del pellet super-incolla in termosaldati punta micropipetta che già contiene 0,2 ml 20% destrano cryoprotecant (40000Mwt). Centrifugare la miscela nella punta micropipetta a 13000 rpm per 30 secondi e rimuovere il surnatante. Un 5-10 microlitri pellet stretto è visto alla punta sigillato. Un "teflon" a cupola rivestiti in ottone montato Planchet pronto nel braccio di alta pressione congelatore titolare riceve la pasta in una semicupola ed è sigillato con il suo cappello piatto ottone partner. L'assemblea braccio è poi prontamente inserito nel congelatore innescato alta pressione pronto per il congelamento. A 2100 bar di pressione combinato unità Planchet ottone contenente le cellule è rapidamente raffreddato da un getto di azoto liquido ad alta pressione, rimuovere il complesso braccio istantaneamente e immergersi in un bagno di azoto liquido impedisce il Planchet dal riscaldamento. Unità Planchet sono conservati in azoto liquido fino al momento di crio-sezionamento. Per esporre il ben congelati cupola di celle per sezionamento, i due planchets ottone sono accuratamente separati under azoto liquido. La cupola perfettamente congelati di cellule ha un aspetto vitreo, privo di crepe e fessure nucleazione ghiaccio. Questo Planchet viene trasferito in un preraffreddato -170 ° C da camera e montato in modo sicuro sulla crio-microtomo vice-come Chuck. Il cryomicrotome raffreddato contiene cryotools essenziali necessari per il sezionamento, questi includono: un basso angolo di crio-diamante coltello, un utensile diamantato taglio, la piattaforma di stampa, stoccaggio casella della griglia, un anti-statico unità spray e un apparato di rete dell'azienda. Per nastro successo sezionamento una regione esterna a forma di cupola è inizialmente di piazza <0,2 millimetri dallo strumento diamante taglio e una velocità rapida di sezionamento, pur mantenendo la profondità ~ 200μm di perimetro ben ghiacciato. Con lo spray antistatici rivolta al coltello angolo basso e griglie di rame sostegno nelle immediate vicinanze, il coltello di diamante è accuratamente avanzato al volto blocco lucidato pronto per il sezionamento. Parametri microtomo sono scelti, ad esempio un'impostazione di sezione spessore da 50 a 350 nm, insieme a una velocità di taglio di circa 0.4mm/sec e finestra taglio stretto. E 'importante controllare la gamma antistatico spray e intensità alle condizioni di bassa umidità nelle immediate vicinanze. Mentre le prime sezioni sono prodotte un applicatore ciglia fine è manovrato a mano o al micromanipolatore intoppo prime sezioni scivoli dal basso diamante bordo angolo coltello. Mentre il nastro di sezioni è costretto fuori il coltello, sono gentilmente supportata da una sonda ciglia e guidato attraverso il supporto di rete in rame nelle vicinanze. Attaccare le sezioni, la griglia caricato con nastri viene poi pressato con un raffreddamento ad lucido-argento sonda, alcune sezioni sono così alta carica i più recenti dispositivi antistatici può aiutare nel processo di adesione. Scatole di griglia sono conservati per la conservazione a lungo termine in un azoto liquido raffreddato spedizioniere a secco fino a quando il microscopio è pronto per il trasferimento della griglia. IV. Esaminare le celle usando il microscopio ottico Cryo Le cellule batteriche sulla griglia di partenza può essere ripreso con il microscopio ottico crio (cryoLM). Il microscopio che usiamo qui è un microscopio invertito Nikon costume Ti E / B con olio extra lunga distanza di lavoro (ELWD) lente d'aria obiettivo 60x. Le griglie sono conservati in una fase criogenica durante l'imaging, che è una versione modificata del FEI fase crio per microscopio ottico. Utilizzando una griglia finder, le cellule possono essere ubicati nelle piazze della griglia e le immagini cryoLM essere correlata al tomogrammi cryoEM. Carico griglie nelle cartucce a crio-stazione. Le cartucce sono personalizzati modificati dalla nostra cartuccia standard EM per la FEI TF30H-Polara. La griglia è tenuto premuto da anelli fermaglio di rame. La cartuccia viene poi conservato in un tubo in azoto liquido per il trasferimento. Raffreddare la fase di crio fino alla temperatura dell'azoto liquido (-190 ° C). Caricare la cartuccia nella fase crio e spostare la griglia nella finestra di visualizzazione. Lo stadio può contenere fino a due cartucce personalizzati modificato. Abbassare la lente condensatore e mettere a fuoco la lente 60x obiettivo sulla griglia. Trova le cellule e prendere le immagini. Per LM correlati e di studio EM, la griglia viene sottoposto a scansione intorno alla zona delle celle, per individuare le cellule più avanti in EM. Dopo l'imaging la griglia, mettere la cartuccia nel tubo e tenere il tubo in azoto liquido fino al momento di essere ripreso in EM. V. Raccogliere Serie Tilt nel TEM Cryo Per ottenere una tomografia 3D della cellula batterica, una serie di immagini di proiezione sono prese mentre il campione è inclinato in modo incrementale lungo uno o due assi nella TEM criogenico. Data la angoli di inclinazione e altre impostazioni sperimentali, ci sono diversi software diversi disponibili per raccogliere automaticamente le serie inclinazione. Noi usiamo per i nostri Leginon TEM crio che è FEI TF30H-Polara. Permette di prendere automaticamente le serie inclinazione delle cellule preselezionato 8. Caricare le cartucce nel supporto multi-selezione (MSH), sulla stazione preraffreddato criogenico. Il MSH può contenere fino a 6 cartucce. Collegare il MSH al TF30H-Polara, scegliere una cartuccia e inserirla nella colonna EM. Inizio Leginon-client sul computer EM e programma Leginon principale sulla workstation altri. Impostare preset (condizioni immagine) per una sessione Leginon. I parametri importanti sono l'ingrandimento, sotto il valore di messa a fuoco, la dose di elettroni e gli angoli di inclinazione per la serie tilt, tra cui angolo di partenza, angolo finale e incrementi. Scegliere gli obiettivi su immagini a partire dal più basso ingrandimento e inviarli al passo successivo con maggiore ingrandimento. In coda tutti gli obiettivi per il tilt-serie raccolta e sottoporre tutti alla fase finale "tomografia". Il processo di raccolta dati può essere monitorato attraverso il web-tool da una workstation locale. Dopo la raccolta di dati sperimentali è fatto, giùcaricare il completamento di inclinazione della serie su una workstation locale per la ricostruzione. VI. Biosicurezza considerazioni La maggior parte dei campioni biologici con cui lavoriamo non sono patogeni e sono stati isolati dal suolo, l'acqua del rubinetto o l'intestino degli insetti. Base tecnica asettica è sufficiente per la gestione di questi campioni. Lavorare con agenti patogeni richiede l'implementazione di misure di sicurezza supplementari, ma per i pericoli estremi, alcuni laboratori hanno installato l'intero Cryo-EM microscopi all'interno BSL-3 laboratori. I seguenti sono alcuni dei modi in cui abbiamo ridotto il rischio di lavorare con agenti patogeni nel nostro laboratorio. La patogenicità di un campione può essere attenuata chimicamente o geneticamente. Molti laboratori facendo Cryo-EM di virus li hanno inattivato con fissativi chimici prima di tuffarsi-congelamento. In alternativa, le mutazioni chiave può essere introdotte che rendono i campioni non-infettivi, tra cui per esempio mutazioni inattivanti punto in alcuni enzimi o buttare giù recettori. Dispositivi di protezione personale come guanti, camice da laboratorio e occhiali devono essere indossati. Campioni pericolosi possono essere manipolati in cabine di sicurezza biologica (BSC). Le colture batteriche possono essere coltivate, concentrato, e persino immergersi congelato su EM griglie del BSC. Abbiamo un piccolo manuale a tuffo congelamento dispositivo che si inserisce nella nostra BSC per questo scopo. Se la consistenza maggiore offered da automatico a tuffo-congelatori è necessario, possono essere introdotti nel BSC, o, più semplicemente, in alcuni casi abbiamo sostenuto le pastiglie assorbente del nostro Vitrobot con un foglio di alluminio per evitare la contaminazione del dispositivo. Quando si lavora con un BSC, come molti degli strumenti e dei materiali il più possibile andare dentro o fuori dal governo dovrebbero essere disinfettati con il 70% di etanolo. Nel preparare le nostre griglie, usiamo piccoli volumi di una coltura batterica o virale (di solito 4 ul), la maggior parte dei quali viene cancellata dalla carta Whatman. La carta assorbente, puntali, e la cultura rimanenti vengono smaltiti come rifiuti a rischio biologico. Tutti gli utensili e le superfici esposte sono disinfettati con candeggina diluita, il 95% di etanolo e poi acqua. Una volta che le griglie sono congelati, sono tenuti alla temperatura dell'azoto liquido in tutta la raccolta e memorizzazione dei dati. E 'stato dimostrato che le cellule possono sopravvivere congelamento e scongelamento poi, però, così si continua a trattarli come pericolosi per tutta la raccolta e memorizzazione dei dati. Al termine della raccolta dei dati, le cartucce contenenti griglie congelati vengono rimossi dal crio-TEM e sceso direttamente in alcool al 70%. Mentre rari, va notato che a volte le reti sono "caduto" all'interno della colonna, e le conseguenze di un tale evento deve essere prevista per ogni campione pericolosi. La maggior parte del microscopio sia a temperatura ambiente, quindi il campione su una griglia caduto probabilmente disgelo all'interno della colonna e diventano completamente essiccato in ultra-alto vuoto di EM. Ciò, ovviamente, inattivare alcuni campioni biologici, ma forse non virus robusta, ei resti essiccata del campione potrebbe essere rilasciato sotto forma di aerosol quando la colonna microscopio è aperta per il servizio successivo. VII. Tomogramma ricostruzione Il tomogrammi delle cellule batteriche sono ricostruiti attraverso il software. Ci sono diversi software disponibili per questo lavoro. Noi usiamo Raptor per la ricostruzione automatica e tomogrammi screening. 9 Come allineamento automatico serie inclinazione e successiva ricostruzione è un compito non banale, Raptor attualmente non ha un tasso di successo del 100%. Nel caso di fallimento Raptor o la necessità di una elevata qualità della ricostruzione, si usa l'allineamento manuale delle immagini e ricostruzione con eTomo nella suite di software IMOD tomografia. 10, 11 Scarica ogni singola serie tilt il server web della Leginon locale. Salvarli in una directory dove possono essere facilmente individuato. Controllare manualmente la serie tilt con spettatore 3dmod IMOD e scartare quelli in cui Leginon ha fallito il tracciamento della destinazione o producendo una serie utile di inclinazione. Noi usiamo Raptor distribuiti su macchine Linux in laboratorio attraverso Peach (una perla sistema basato la distribuzione degli incarichi su una rete). Noi specificare le dimensioni del nostro marker fiduciali, ovvero le particelle d'oro colloidale, il numero di marcatori da utilizzare per la ricostruzione, il pixel, dimensioni, lo spessore desiderato della ricostruzione, il fattore di binning e una serie di impostazioni di base (ad esempio come input, percorsi di uscita e il formato di output) sulla riga di comando e lasciare correre, in genere 20 minuti a 2 ore per una immagine-122-set di dati (da 2k 2k). Se soddisfatti del risultato ricostruzione, la procedura descritta in questa sezione può essere saltata. Quando la ricostruzione manuale è necessario, rinominare i file da ". MRC" a ". °" e caricare singole serie tilt nella GUI eTomo nella suite tomografia IMOD. Specificare serie del tipo di inclinazione asse (gli assi singolo o doppio), e inserire le dimensioni fiduciali utilizzati in sapreparazione mple. Scansione l'intestazione del file per determinare la dimensione dei pixel, e continua cliccando su "Crea script Com". Seguire i passi di ogni scheda nella GUI eTomo di ricostruire la tomogramma della serie tilt. Ispezionare e verificare il risultato dopo ogni passaggio, e se non soddisfatti, possiamo sempre tornare indietro ad ogni passo precedente e rielaborare da lì. "Pre-processing" è quello di eseguire l'elaborazione di preparazione e rimuovere anormalmente alta intensità pixel causati dai raggi X. "Allineamento Coarse" produce una serie di inclinazione in cui ogni immagine successiva proiezione della serie inclinazione è allineata a quella precedente da cross-correlazione. Si definiscono quali perline d'oro da utilizzare come fiducial in "Generazione modello Fiducial", e il programma tiene traccia del marker fiduciali in ogni immagine di proiezione e costruisce "Allineamento Fine". "Posizionamento tomografia" permette di ritagliare l'tomogramma in Z. "Final Stack Allineato" viene generata mediante interpolazione lineare, e funzioni quali la CTF-correzione, Gold-Eraser e 2D di filtraggio possono essere applicati a scelta. La tomografia è calcolato in "Generate tomografia" da ponderato di back-proiezione nello spazio di Fourier. "Post-processing" consente di ritaglio della tomografia a XY regione di interesse e il contrasto di scala nel campo delle strutture di interesse, e "Clean Up" cancella i file intermedi e libera lo spazio su disco. VIII. Conservazione del tomogrammi nel database Usiamo un web-based in-house database per organizzare, archiviare, cercare e distribuire i dati tomografici. Per ogni serie di inclinazione, siamo in grado di registrare i dettagli del campione, i parametri di raccolta microscopio, serie tilt prime, nonché associati ricostruzione 3D e file di altre lavorazioni. La pagina di navigazione principale presenta una miniatura e una funzionalità "YouTube", come film per ogni tomogramma, e le voci possono essere organizzati tramite download frequenza, tipo creatore campione, o data. Gli utenti possono consultare il database inserendo parole chiave o funzioni speciali. Attualmente oltre 4.500 serie tilt tomografiche sono state depositate nella banca dati, che copre quasi 60 tipi di specie / campione, con un totale di oltre 11.000 file associati. IX. Analisi e segmentazione del tomogrammi I dettagli strutturali del tomogrammi possono essere visualizzati e analizzati attraverso diversi software con strumenti di elaborazione delle immagini, ad esempio, visualizzatore di 3dmod IMOD con ZAP, XYZ e finestra Slicer. Il passo successivo è quello di creare una segmentazione dell'immagine 3D (tomografia). Una segmentazione assegna ad ogni voxel (pixel volumetrico) dell'immagine 3D una etichetta che descrive a quale regione o materiale voxel appartiene, ad esempio, una membrana o un citoscheletro. Utilizziamo strumenti software come 3dmod in IMOD e Amira (Imaging Visage). Anche se alcuni strumenti software forniscono moduli segmentazione automatica (ad esempio, la segmentazione soglia), spesso funzionano solo per le immagini con alto contrasto. Le immagini 3D derivate da basse dosi di cryotomography elettroni sono così basso contrasto che nella maggior parte dei casi, dobbiamo assegnare manualmente un'etichetta a ogni voxel. La segmentazione è memorizzato in un file di dati separato. Può essere utilizzato per generare un modello di superficie nella quale è indicato ogni regione con un colore diverso e visualizzati in 3D. Il tomogrammi può essere utilizzato per altre analisi. Per esempio, la corrispondenza di modello e successivo calcolo può produrre informazioni statistiche del complesso macromolecolare come ribosomi. Allineamento sottovolume e media spettacoli strutture in contrasto elevato e rivela i dettagli più fini. X. Fare film sulla base di tomogrammi Noi facciamo film per riassumere ogni progetto e di dare una panoramica visiva delle nostre immagini tomografiche. Fai uno script delle caratteristiche dei dati vorremmo mostrare e come rendere queste caratteristiche. Per esempio, in un film tipico di un tutto-cellula di progetto tomografia, si inizia mostrando un rappresentante dati serie tilt e poi seguire con una fetta-per-fetta vista del tomogramma ricostruito. Successivamente, mostrano una segmentazione di macromolecole chiave nella cella, per esempio, un motore flagellare o un complesso chemoreceptor o un filamento citosolico. Infine, concludiamo con un modello che mostra un'interpretazione idealizzata delle macromolecole che stiamo studiando. Rappresentazione software di grafica come Amira o Chimera sono utilizzati per rendere l'singoli fotogrammi ancora del film. Noi di solito montare filmati da brevi clip di facilitare le evoluzioni a ogni clip. Utilizzare software commerciali di editing video come Adobe Premiere per assemblare i telai ancora nei clip filmato, e poi i filmati nel film finale. Abbiamo iniziato ad aggiungere una traccia audio che racconta il film. La narrazione agisce come una "leggenda film" e permette al pubblico di concentrarsi sui dati che vengono presentati durante la visione del film. XI. Animazione Visivonarrazione comunica conoscenza senza richiedere il vocabolario complesso di specifici settori scientifici. Concetti difficili diventano semplici se accompagnati da dimostrazione visiva. La pratica di illustrare idee biologico con i fumetti non è una novità. Tuttavia, solo negli ultimi dieci anni hanno la sofisticati strumenti professionali per la creazione di contenuti 3D state portate a sopportare il compito di costruire animazioni scientifiche. Ora ci sono decine di ricercatori attivamente tradurre in sistemi biologici dinamici animazioni 3D. Molte belle animazioni sono in mostra a http://MolecularMovies.org . Questo sito ospita anche tutorial e distribuisce un toolkit gratuito per la manipolazione di strutture molecolari in Autodesk Maya. L'open source suite di contenuti 3D, Blender, contiene diversi importatori PPB generati dagli utenti. Il processo di creazione di una animazione 3D comporta in genere tre fasi: Modellazione: Utilizziamo software rappresentazione grafica di esportare superfici in formati che possono essere importati in Maya. Queste superfici sono o segmentazioni da tomogrammi ricostruito, per esempio, membrane, granuli o filamenti, o rappresentazioni di superfici molecolari. Segmentazioni tomogramma vengono eseguiti in Amira; superfici molecolari sono generati in Chimera o VMD. Rappresentazioni atomiche di molecole possono essere importati direttamente in Maya dai file PDB. Una volta che i modelli sono in Maya, che può essere modificato, duplicato, e posizionato a seconda dei casi. Animare: Le animazioni sono tradizionalmente costruite a mano, con l'artista manualmente lo spostamento di oggetti in movimento e la registrazione di una serie di fotogrammi chiave. Nuovi progressi nel software di grafica 3D permettono ora le dinamiche che saranno generati proceduralmente, attraverso moduli built-in e scripting API. Rendering: dinamiche procedurali in grado di fornire animazioni convincenti dei processi biologici dinamici, come ad esempio strutturale auto-assemblaggio. Eppure, a causa della difficoltà di simulare realisticamente i sistemi biologici, la maggior parte delle animazioni 3D sono ancora costruiti con tecniche tradizionali fotogramma chiave. Una volta che le dinamiche sono in ordine, le annotazioni visive, texture e effetti di luce possono essere aggiunti. Infine, il percorso fotocamera è scelto e l'animazione completa è reso in un film.