Rilevazione SDS-PAGE/Immunoblot di multimeri Aβ in Human tessuto corticale omogenati utilizzando Antigen-epitopi recupero
Summary
Abbiamo descritto una tecnica per la preparazione di omogenati chiarito umano corticale, la separazione delle proteine mediante SDS-PAGE, recupero antigene e immunoblotting con un anticorpo per il peptide Aβ. Usando questo protocollo, abbiamo costantemente rilevare Aβ monomerici e multimerica nel tessuto corticale da esseri umani con patologia di Alzheimer.
Abstract
Il ripiegamento anomalo e polimerizzazione del β-amiloide (Aβ) peptide è pensato di avviare la cascata neurodegenerative nella patogenesi della malattia di Alzheimer<sup> 1</sup>. Aβ è prevalentemente un 40 – peptide acido o 42 aminoacidi che è incline a auto-aggregazione in β-sheet ricco di fibrille amiloidi che si trovano nei nuclei delle placche senili cerebrali nella malattia di Alzheimer. Crescente evidenza suggerisce che a basso peso molecolare, multimeri Aβ solubile sono più tossici amiloide Aβ fibrillare<sup> 2</sup>. L'identificazione e la quantificazione a basso e ad alto peso molecolare, specie Aβ multimerica nel tessuto cerebrale è un obiettivo essenziale nella ricerca sulla malattia di Alzheimer, e dei metodi impiegati può essere applicata per l'identificazione e la caratterizzazione dei multimeri tossici in altre proteopathies<sup> 3</sup>. Naturalmente multimeri Aβ può essere rilevato da SDS-poliacrilammide gel elettroforesi seguita da immunoblotting con anticorpi specifici anti-Aβ. Tuttavia, la separazione e la rilevazione di Aβ multimerica richiede l'uso di alta concentrazione omogenati corticale e recupero dell'antigene in piccoli pori di dimensioni membrane di nitrocellulosa. Qui si descrive una tecnica per la preparazione di omogenati chiarito umano corticale, la separazione delle proteine mediante SDS-PAGE, e antigene-epitopo recupero / 6E10 blotting con anticorpi verso la regione N-terminale del peptide Aβ occidentale. Usando questo protocollo, abbiamo costantemente rilevare Aβ monomeri, dimeri, trimeri, tetrameri, e superiori multimeri peso molecolare nel tessuto corticale da esseri umani con patologia di Alzheimer.
Protocol
Discussion
Nonostante l'importanza di aggregazione Aβ nella patogenesi della malattia di Alzheimer 1,4,5, pochi studi hanno descritto o quantificata la distribuzione di diversi multimeri Aβ in campioni di tessuto umano corticale 2. Comunemente usato tecniche immunoistochimiche non consentono la discriminazione di specie distinte Aβ multimerica nel fisso tessuto corticale. Non fissati in omogenati di tessuto corticale, multimeri Aβ possono essere separati e biochimicamente valutata mediante elettrofore…
Acknowledgements
Molte grazie a Elaine Pranski e Carolyn Suwyn per un'eccellente assistenza tecnica e di Harry LeVine III, M. Paul Murphy, e ingranaggi per le conversazioni importanti Marla. Il finanziamento è stato fornito da RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, la Fondazione Woodruff e la Emory University Comitato di ricerca.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Santa Cruz Biotechnology | Sc-29130 | 1 tablet in 25ml buffer | |
| BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | ||
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | ||
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC1676 | ||
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Invitrogen | NP0004 | ||
| SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen | LC5925 | ||
| Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | EC6625BOX | ||
| Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size | Invitrogen | LC2000 | ||
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Will not interfere with immunostaining | |
| ATX Ponceau S Red staining solution | Sigma Aldrich | 09276 | Will not interfere with immunostaining | |
| Kapak heat sealable plastic sample pouches | Fisher Scientific | 0181225AA | ||
| 6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16) | Covance | SIG-39320 | Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | ||
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931-1ML | Dilute at 1:10,000 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | ThermoFisher | 34077 | ||
| Kodak Biomax MR Film | Carestream Health | 870 1302 |
References
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- Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer’s disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
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