Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

1. Örnek Protein Hazırlık 500 ul mikrofuge'de tüp, aşağıdaki bir araya getirir: Reaktif Eklemek için Cilt: * Protein örneği (1 mg) 112 mcL Kartuş kiti sağlanan örnek Tampon (5X) 30 mcL DTT 1M 8μL 18 Ω H 2 O x 150μL örnek hacminin toplam mcL ** Örnekleri 95 ° C'de 5 dakika denatüre. Oda sıcaklığında soğutun. * Ayrılmış protein toplam miktarın örnek karmaşıklığına bağlı olacaktır. , Doku Homojenat gibi daha karmaşık örnekleri, için, kanal başına 150-200 mg tavsiye edilir . Örnek hacmi 112 mcL az **, 150 mcL nihai hacmi getirmek için 18 Ω H 2 O ekleyin. 2. GELFREE Kartuş Yükleniyor GELFREE 8100 Kartuşu folyo poşetten çıkarın. Plaka macunu çıkarın ve atın. Bir pipet kullanarak kartuşu bölmesine depolama tampon çıkarın. Kartuş 8 odaları kullanılacaksa, kartuşu saklama bölmeleri tampon drenaj ters olabilir. Her kartuş odaları için aşağıdaki gibi GELFREE Koşu Tampon ekleyerek kartuşu yükleme için hazırlayın: GELFREE Kartuş Odası Ses eklemek GELFREE Koşu Tampon Anot tampon haznesi 8 mL Katot tampon rezervuar 6 ml Koleksiyon odaları Her biri 100 mcL Örnek bir yükleme bölmesine herhangi bir tampon çıkarıp atın. 8 kanallı pipet kullanarak yükleme odalarına 150 mcL örnekleri yükleyin. GELFREE 8100 Fraksiyonu Station içine yüklenen kartuş yerleştirin. Elektrot dizileri indirin ve kapağını kapatın. 3. Kartuş Koşu Cihazın dokunmatik ekran kullanarak, önceden programlanmış yöntemleri listesini görmek için yöntem düğmesine basın. Önceden programlanmış yöntemleri Her proteinlerin molekül ağırlıkları belirli bir aralık içinde çözmek için tasarlanmış belirlenen gerilimler ve zaman bazlı duraklar oluşur. GELFREE 8100 fraksiyon toplanması için yöntem belirtilen aralıklarla otomatik olarak ara. Uygun bir yöntem tespit edildikten sonra, geri alma tuşuna basın ve ekrandaki tuş takımını kullanarak istediğiniz önceden programlanmış bir yöntem numarasını girin . OK tuşuna basın, daha sonra uygula düğmesine basın. Uygulanan yöntem, ana ekranın alt kısmında görünecektir. Vadede kullanılacak kanallar (numune sayısı) seçmek için, ana ekranda kanal düğmesine basın. Sekiz kanal seçmek için, tümünü seç tuşuna basın. Daha sonra, ana ekrana dönmek için yapılan basın. Emniyet kapağı kapalı olduğundan emin olun ve gösterge ışığı ekranın altındaki yeşil olduğunu. Protein ayırma başlatmak için, start tuşuna basın. Kesirler Not toplamak için zamanı geldiğinde Fraksiyonu İstasyonu duraklama otomatik olarak sistem çalışırken, ekranın sol tarafındaki kutuya gösterilen çevreler her kanalın durumunu tasvir. Yeşil bir daire kanalı aktif olduğunu gösterir, sarı bir daire, enstrüman duraklatılmış olduğunu gösterir ve kırmızı bir daire kanalı başarısız olduğunu gösterir . Uygulanan gerilim ve akımların kanal durumu çevrelerin sağ görüntülenir. Durumunu çevrelerin açık sarı ve bir metin uyarı alet s ekranda göründüğünde Kesirler sadece çıkarılmalıdır. Kesirler kaldırmak için, cihazın kapağını açın ve toplama odalarının her birinden 150 mcL çekmek için 8 kanallı pipet kullanın. Kesirler çıkarıldıktan sonra, kanal başına 100 ul ekleyerek ve iki kez yukarı ve aşağı pipetleme GELFREE Koşu Tampon toplama haznesi iki kez yıkayın. Yıkadıktan sonra, toplama odalarına geri Tampon Koşu GELFREE 100uL ekleyin, kapağını kapatın, ve devam düğmesine basın . GELFREE 8100 sonraki zaman aralığı kadar sürecek. Deneyde kalan toplam süre ekranın sağ tarafında gösterilir. Kalan süre arasında geçiş yapmak için, bir süre geçtikten ve duraklama zamanı, zaman gösteren kutusunun üzerindeki düğmeye basın . Bir kere bütün fraksiyonlarının ortak olmuşturllected, hemen izoelektrik odaklama veya jel elektroforezi gibi daha fazla downstream hazırlanması, veya likit kromatografi kütle spektrometresi veya immünoafinite kullanarak analizi için kullanılan olabilir. 4. Temsilcisi Sonuçlar GELFREE Fraksiyonu Sistemi kullanılarak, her birine 12 kesirler sığır karaciğer Homojenat 200 mg bölündü. Her fraksiyonu 6 mcL bir standart 1D SDS PAGE jel ve gümüş boyanan çalıştırıldı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, protein örneği 3.5kDa 150kDa için moleküler ağırlık aralığı kapsayan, 12 farklı fraksiyonları fraksiyone oldu. 1 ve 14 şeritli bir moleküler ağırlık standardı (ColorBurst Sigma) gösterilmiştir. Burada gösterilen jel protein fraksiyonasyon GELFREE 8100 sistemini kullanarak elde edilen yüksek iyileşme oranı vurgulamaktadır. Burada gösterilen 200 mg kurtarıldı protein jel% 4 oranında temsil eder. Şekil 1. Sığır karaciğer Proteinler GELFREE Fraksiyonu sistemi kullanılarak ayrılır Homojenat. Yüklenen her 150 mcL fraksiyonu 6 mcL ve 1D SDS PAGE jel ve gümüş boyanan çalıştırıldı. Belirtildiği gibi bir molekül ağırlığı (MW) standardı da yüklendi. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .