Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

1. Preparação de proteínas da amostra Em um tubo de microcentrífuga 500 mL, combine o seguinte: Reagente Volume de acrescentar: * Amostra de proteína (até 1 mg) Até 112 mL Tampão de amostra (5X) fornecido em cartucho kit 30 mL TDT 1M 8μL 18 Ω H 2 O x mL para um total de volume de amostra de 150μL ** Desnaturar as amostras a 95 ° C por 5 minutos. Arrefecer à temperatura ambiente. * A quantidade total de proteína a ser separados dependerá da complexidade da amostra. Para amostras mais complexas, tais como tecido homogeneizado, 150-200 mg por canal é recomendado. ** Se o volume da amostra é inferior a 112 mL, adicionar 18 Ω H 2 O para trazer o volume final de 150 mL. 2. Carregar o cartucho GELFREE Remova o cartucho de 8100 GELFREE da embalagem de alumínio. Remova e descarte o selador de placa. Remover o buffer de armazenamento dos compartimentos do cartucho com uma pipeta. Se todos os 8 câmaras do cartucho será utilizado, o cartucho pode ser invertida para drenar o buffer de armazenamento dos compartimentos. Prepare o cartucho para carregar adicionando tampão de corrida GELFREE para cada uma das câmaras do cartucho da seguinte forma: GELFREE Cartucho Câmara Volume de GELFREE tampão de corrida para adicionar Reservatório de tampão ânodo 8 mL Catodo reservatório tampão 6 mL Coleta de câmaras 100 L cada Remover e descartar qualquer tampão da câmara de carga da amostra. Carregar os 150 amostras mL para as câmaras de carregamento com uma pipeta de 8 canais. Coloque o cartucho carregado na Estação Fracionamento GELFREE 8100. Inferiores as matrizes de eletrodos e feche a tampa. 3. Executando o cartucho Utilizar o instrumento s tela sensível ao toque, pressione o botão método para ver a lista de pré-programadas métodos. Cada um dos métodos pré-programados consiste em definir e tensões baseadas em tempo pausas destinadas a resolver as proteínas dentro de uma faixa específica de pesos moleculares. O 8100 GELFREE automaticamente pausa para coleta de fração nos intervalos especificados no método. Uma vez que o método adequado foi identificado, pressione o botão recuperar, e digite o número desejado do método de pré-programados usando o teclado na tela. Pressione ok, em seguida, pressione o botão aplicar. O método que tem sido aplicado irá aparecer na parte inferior da tela principal. Para selecionar os canais (número de amostras) que será usado na corrida, pressione o botão de canal na tela principal. Para selecionar todos os oito canais, pressione selecionar todos. Em seguida, pressione feito para voltar à tela principal. Garantir que a tampa de segurança é fechada e que o indicador está verde na parte inferior da tela. Para começar a separação de proteínas, pressione o começo. A Estação de Fracionamento automaticamente pausa quando é hora de coletar frações. Nota: Enquanto o sistema estiver em execução, os círculos mostrados na caixa do lado esquerdo da tela retratam o estado de cada canal. Um círculo verde indica que o canal está ativo, um círculo amarelo indica que o instrumento tem uma pausa e um círculo vermelho indica que o canal tenha falhado. As tensões e correntes aplicadas são exibidos à direita dos círculos status do canal. Frações só deve ser removido quando o status de círculos ficaram amarelas e um alerta de texto aparece na tela do instrumento s. Para remover frações, abra a tampa do instrumento e usar uma pipeta de 8 canais para retirar 150 mL de cada uma das câmaras de coleta. Uma vez que as frações foram retiradas, lave a câmara de coleta duas vezes com tampão de corrida GELFREE adicionando 100 ul por canal e pipetando para cima e para baixo duas vezes. Após a lavagem, adicione 100uL de GELFREE tampão de corrida de volta para as câmaras de coleta, feche a tampa e pressione o botão Continuar. O GELFREE 8100 vai decorrer até ao próximo intervalo. O tempo total restante no experimento é mostrado no lado direito da tela. Para alternar entre o tempo restante, tempo decorrido e tempo de pausa, pressione o botão acima da caixa de exibição de tempo. Depois de todas as frações foram collected, eles podem ser imediatamente utilizada para a preparação mais a jusante, como a focalização isoelétrica ou eletroforese em gel, ou para análise por espectrometria de massa de cromatografia líquida ou de imunoafinidade. 4. Resultados representante A mcg 200 de homogeneizado de fígado bovino foi dividido em 12 frações de cada um, utilizando o Sistema de Fracionamento GELFREE. 6 mL de cada fração foi executado em um padrão de gel PAGE 1D SDS e corados de prata. Conforme mostrado na Figura 1, a amostra de proteína foi fracionado em 12 frações distintas, abrangendo a faixa de peso molecular de 150kDa para 3.5kDa. Um padrão de peso molecular (Colorburst, Sigma) também são mostrados em faixas 1 e 14. O gel mostrado aqui destaca a taxa de recuperação alta alcançada usando o sistema de 8100 GELFREE para fracionamento de proteínas. O gel mostrado aqui representa 4% da proteína recuperada de 200 mg. Figura 1. Proteínas de fígado bovino homogeneizado separados usando o sistema de fracionamento GELFREE. 6 mL de cada fração 150 mL foi carregado e executado em um gel 1D PAGE SDS e corados de prata. Um padrão de peso molecular (MW) também foi carregado, conforme indicado. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.