Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

1. Insan kanı PMN İzolasyon Antikoagülan olarak EDTA veya heparin (10 U / ml) ile 24 ml insan kanı hakkında kullanın. 6 ml, 15 ml Falcon tüp Histopaque 1119 ekleyin ve dikkatle üst katmanı 5 ila 7 ml tam kan. Frenleme olmadan 20 dakika boyunca 800 xg'de santrifüjleyin. Sarımsı ve açık üst katman aspire edin ve atın ve taze Falcon tüpler içine granülositler içeren alt kırmızımsı faz transfer. 300 x g. 10 dakika PBS ve santrifüj Falcon tüpleri dolum hücreleri yıkayın Bu arada% 100 Percoll, 2 ml 10x PBS, 18 ml Percoll karıştırılarak bir solüsyon hazırlanır. 1x PBS,% 85,% 80,% 75,% 70 ve% Percoll 65 4 ml çözümler hazırlıyoruz. Katmanlama 2 ml azalan birbirlerinin üstüne her yüzde bir Percoll degrade ile 2 Falcon tüpleri hazırlayın. Santrifüj süpernatantı kaldırdıktan sonra, 4 ml PBS pelet ve tekrar süspansiyon tortulaşmış hücreleri birleştirir. Her degradelerin üzerine tabanda dikkatli katman 2 ml. Frenleme olmadan 20 dakika boyunca 800 xg'de santrifüjleyin. Santrifüj üst katmanı kaldırmak ve% 65 katmanlı en PBMC'ler ile,% 85 katmanlı kadar yeni Falcon tüpler içine beyaz kalan interphases toplamak sonra. 300 x g. 10 dakika PBS ve santrifüj ile Falcon tüpleri dolum hücreleri yıkayın PBS 2ml supernatant ve tekrar süspansiyon tortulaşmış hücreleri (genellikle>% 95 PMN.) Çıkarın. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 2. Aktive PMN Steril bir 13 mm yuvarlak cam kapak kayma (1,5) her bir kuyunun içine koyarak 24-iyi bir hücre kültürü tabak hazırlayın Tohum 2 x 10 500μl RPMI 5 hücreleri de başına (% 2 insan serum albümin içeren) ve 37 CO 2 inkübatör 1s inkübe ° C. Bu arada RPMI 600 nM PMA çözüm hazırlamak ve 100μl de ortalama hücreleri ekleyin. CO 2 inkübatör 4 saat 15 dakika inkübe 37 ° ° C. % 4 (son konsantrasyon) PBS içinde çözünmüş paraformaldehid hücreleri saptamak. PMA bir pozitif kontrol olarak hizmet veren ve bugüne kadar NET oluşumunu uyarmak için en güçlü bir ajandır. Alternatif olarak, patojenlerin diğer uyaranlara veya co-ekimi NET indüksiyonu için kullanılabilir. Zaman kursu devam ederken ek paralel olarak hazırladığı numuneler NET oluşumu ilgili durumu kontrol edilebilir. Sabit olmayan hücrelere Sytox Yeşil (Invitrogen) gibi olmayan bir permeant DNA boya eklenirse, sadece ekstraselüler DNA tespit edilecektir. Yeni NET'ler oluşumu şekilde her zaman noktası için, Sytox varlığı bozulmuş olduğundan bir paralel örnek kullanılmalıdır. 3. NET immunolabeling tarafından tespit NET'ler fiksasyon sonra bile çok kırılgan olduğu ve büyük bir dikkatle manipüle edilebilir aksi takdirde çoğunluğu hazırlanması sırasında kaybolan alacak. 24 kuyu kültür plaka takılı hücreleri ile cam kapak fişleri kavisli bir iğne ile kenarında yukarı kaldırarak dikkatlice çıkarın ve ince bir forseps ile ele geçirmek. PBS bir damla ters kapak kayma koyun. Bu bir test tüpü standı kapsayan bir Parafilm kağıda yapılabilir. 3 kez 5 dakika boyunca bu gibi yıkayın. Triton X-100 RT az 1 dakika hücreleri permeabilize için% 0.5 'lik bir düşüş aynı şekilde kapak fişleri inkübe edin. 1 dakika için 3 kez PBS içinde yıkayın. Parafilm ve ıslak mendil ile nemli bir oda hazırlayın. Lay kapağı engelleme tampon (% 5 eşek serum) bir damla baş aşağı kayar ve 37 ° 30 dakika inkübe ° C. Tampon engelleme primer antikorlar, örneğin ms anti Histon ve rb anti nötrofil elastaz, sulandırınız. Primer antikor bir damla üzerine tampon engelleme doğrudan nemli odasında fişleri kapağı ve 37 az 1 saat süreyle inkübe transfer ° C PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayınız. Ikincil antikorlar, örneğin dk anti ms Cy2 ve tampon engelleme dk anti-rb Cy3 sulandırınız. Sekonder antikoru bir damla üzerine nemli odasına fişleri kapağı ve 1 saat boyunca inkübe 37 aktarma ° C. PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayınız. Leke DNA UV eksitasyon veya Draq5 kadar kırmızı uyarma için ihtiyaç ve dist ile iki kez yıkamak Hoechst 33.342 (1 mcg / ml) ile 5 dakika ya, floresan mikroskopi seçenekleri bağlı. su. Bir cam slayt üzerine Mowiol 20μl damla ayarlayın ve hücreleri ile kapak fişleri ters monte. Hücreleri kapak kayma ve slayt arasında olmak zorunda. Mowiol, açılan kapağı açılan kayma yerleştirilmiş homojen kalınlıkta ince bir tabaka oluşturacak. Normalde, örnek basın gerek yoktur. Olmayan daldırma lens kullanmak istiyorsanız, numunenin incelenmesi için hazır.Daldırma lensler ile mikroskobik inceleme için, Mowiol örnek kenarında katılaşmış kadar yaklaşık 1 saat için örnek kuru sağlar. 4. Hazırlanması NET'ler Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) Hücreleri,% 2,5 glutaraldehid ile 24 plaka cam kapak bordroları düzeltmek Mesaj. 24 kuyu kültür plaka hücreleri içeren cam kapak fişleri çıkartın ve bir damla su baş aşağı koymak. 3 kez 5 dakika boyunca bu gibi yıkayın. 30 dakika süreyle% 0,5 OsO4 ve inkübe içeren 24-kuyu hücre kültürü plakası kapak fişleri geri aktarın. 24 kuyu kültür plaka hücreleri içeren cam kapak fişleri çıkartın ve bir damla su baş aşağı koymak. 3 kez 5 dakika boyunca bu gibi yıkayın. 30 dakika süreyle% 1 tannik asit ve inkübe içeren 24-kuyu hücre kültürü plakası kapak fişleri geri aktarın. Adımları tekrarlayın 4,2-4,4 Aşağıdaki rejimi (5 dk her) aracılığıyla dehydrate: % 30 etanol % 50 etanol % 70 etanol % 80 etanol % 90 etanol % 100 etanol % 100 etanol % 100 etanol Kritik nokta kurutma makinesi ve kuru örnekler sığar kapağı aktarın. Coat yüzey ince bir tabaka evaporatör kullanılarak 5nm platin / karbon tabaka ile örnek 5. Temsilcisi Sonuçlar: Izolasyon yöntem genellikle,% 95 daha yüksek bir saflığa sahip unstimulated yaşayabilir nötrofil verir. Stimülasyon sonrasında farklı zaman noktalarında sabit, NETosis düzleşme hücre, nükleer lobülleri kaybı, granül kaybı ve nükleer (yani histon) ve granül (yani artan bir örtüşme yol açar çekirdeği bütünlüğünü sırasında morfolojik değişiklikler immün protokol sırasını gösterir nötrofil elastaz) boyama. Bu protokol, nötrofil ile patojenlerin özel etkileşimlerini analiz etmek için bir başlangıç ​​noktası olarak hizmet verebilir. Bu etkileşim, Taramalı Elektron Mikroskobu için hazırlık protokolü kullanılarak daha ayrıntılı olarak disseke edilebilir. NET Floresans NET bileşenleri (mavi = DNA, kırmızı = histon, yeşil = nötrofil elastaz) lekeli uyarılan nötrofillerin örnek. NET lokalizasyonu, nükleer DNA ve histon yerelleştirme ve nötrofil elastaz için granül desen görüntüleri yanı sıra, göstermektedir. SEM PMA stimülasyon Olmayan uyarılır ve PMA-uyarılan nötrofillerin gösteren tarama elektron mikrografı. Stimülasyon sonra, nötrofil düzleştirmek ve NET'ler üretmek. SEM NET'ler ve Shigella NET'ler sıkışıp Shigella bakterileri Yüksek çözünürlüklü SEM görüntü.