Cellulaire Encapsulation in 3D Hydrogelen voor Tissue Engineering

A. Materiaal Voorbereiding en Sterilisatie Voorafgaand aan de voorbereiding van inkapseling materialen, bereiden een 0,5 gew% oplossing van de foto-initiator Irgacure 2959 (I2959) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), door het mengen en incubatie gedurende enkele dagen bij 37 ° C. De oplossing kan dan worden gefilterd spuit voor sterilisatie en opgeslagen bij kamertemperatuur langdurig gebruik. Op basis van de gewenste samenstelling van gels worden gesynthetiseerd, te berekenen (met behulp van een spreadsheet programma zoals Microsoft Excel) het gewicht van het polymeer en crosslinker nodig. Omdat een bepaald gewicht van het polymeer moet worden opgelost in een bepaald totaal volume tot een gewenste concentratie te bereiken in de hydrogels, de crosslinker en de polymeeroplossing gedeelten van het totale volume gel moet ook worden bepaald met behulp van de spreadsheet. Vergelijkbare berekeningen moeten worden gemaakt als een hanger groepen (bijvoorbeeld een lijm RGD-of YGSR met oligopeptide) moeten voorafgaand aan de verknoping worden opgenomen. Weeg de benodigde hoeveelheid van het polymeer en crosslinker en plaats in Eppendorf buizen. Dienovereenkomstig aan te passen voor de berekening spreadsheet voor het werkelijke gewicht van het polymeer verkregen. (Opmerking: de volumes kan worden gewijzigd om te compenseren voor de eigen massa van polymeer en crosslinker verkregen). Bereid gel mallen met behulp van een scheermesje naar de toppen afsnijden van individueel verpakte steriele 1 ml wegwerpspuiten. Zorg voor een vlakke snede wordt gemaakt voor mallen worden gebruikt voor photopatterned gels. Plaats de spuit mallen, Eppendorf buizen (met dop open) en alle andere benodigde materialen onder een kiemdodend lichtbron (meestal ingebouwd in biologische veiligheid kasten) en steriliseer gedurende 30 minuten. B. celpreparaat Na de sterilisatie, voeg de geschikte steriele buffer volume (per spreadsheet berekeningen, terwijl de keuze van de buffer kan variëren, PBS en een zwakke base buffer, zoals triethanolamine worden doorgaans gebruikt voor de vrije radicalen en michael-type crosslinking, respectievelijk) het polymeer Eppendorf en (optioneel) hanger groep te worden opgenomen (bv., lijm peptide) en vortex te ontbinden (als vortexen buiten het steriele kap wikkel de Eppendorf met parafilm). Voeg de juiste hoeveelheid van de hanger groep oplossing voor de polymeeroplossing en wikkel de afdichting met parafilm. Kort vortex en incuberen bij 37 ° C te reageren (indien mogelijk, bovenop een roterende roer plaat) tijdens de celdeling voorbereiding. Het gaat om de reactie van een thiol op een peptide (via cysteïne groep) om een ​​of-methacrylaat, zodat het peptide is opgenomen als een hanger groep in de finale hydrogel. Trypsinize en tellen cellen en scheiden in porties van het juiste nummer voor elke set van gels. Bijvoorbeeld voor een set van drie 50 uL gels bij een dichtheid van 10 miljoen cellen / ml, afzonderlijke 1,5 miljoen cellen in een individuele conische buis. Het wordt aanbevolen om niet meer dan 4 gels worden opgesteld in een individuele set te wijten aan de timing van gelering (let op: als het synthetiseren van meerdere sets van gels, een Eppendorf met een voldoende volume van de polymeer-oplossing voor alle sets kunnen worden bereid). Centrifugeer de cellen. Terwijl de cellen zijn te stoppen met draaien Light geïnitieerd door vrije radicalen verknoping: voeg 0,5 gew% I2959 oplossing voor de polymeeroplossing die gelijk is aan 10% van het totale gel ingestelde volume (voor een laatste initiator concentratie van 0,05 gew%). Michael-type (toevoeging) verknopen: voeg buffer aan de crosslinker om de juiste concentratie oplossing te komen. Voor sequentiële verknoping: deze gels bevatten beide typen van verknoping en vereisen zowel van de vorige stappen. C. Hydrogel Formation Aspireren supernatans van de gecentrifugeerd cel gedeelte. Wacht tot vloeistof tot rust na de eerste aspiratie en re-aspiratie om zoveel mogelijk media te verwijderen zonder verstoring van de cel pellet. Resuspendeer de celpellet met de polymeeroplossing tot cellen zijn gelijkmatig verdeeld. Minimaliseer blaasvorming door het langzaam pipetteren de oplossing op en neer (ongeveer 10 cycli moet voldoende zijn om cellen te verdelen). Verknoping Hydrogelen Light geïnitieerd door vrije radicalen verknoping: Aliquot het juiste volume in de spuit tip mallen. Expose de spuiten aan UV-licht voor een radicale verknoping (bijvoorbeeld een 10 minuten blootstelling aan 365 nm, 4 mW/cm2 UV-licht is gebruikelijk dat acrylaat gefunctionaliseerde polymeren). Deze stap moet snel worden uitgevoerd om een ​​minimum te beperken cel regelen voordat UV blootstelling aan licht. Michael-type (toevoeging) het verknopen: Met behulp van een brede opening pipettip, voeg de juiste hoeveelheid crosslinker oplossing van het polymeer / cel-oplossing, stelt de pipet op de gewenste individuele gel volume, pipet de oplossing op en neer omhomogeniseren, en hoeveelheid in de spuit tip mallen. Deze stap moet snel worden uitgevoerd om een ​​gelijkmatige verdeling van de cellen te verzekeren. Laat 10-30 minuten (afhankelijk van het individuele systeem) incubatie in de cultuur kap voor verknoping. Sequentiële verknoping: Het gaat om de Michael-type additiereactie en vervolgens blootstelling aan licht voor de tweede verknoping. Slechts een fractie van theoretische crosslinks moet worden gereageerd tijdens de eerste verknoping en vervolgens een steriele masker moet rechtstreeks worden toegepast op de gel oppervlak voorafgaand aan de blootstelling aan het licht met behulp van gesteriliseerde pincet. Een gefunctionaliseerde kleurstof (bv. methacrylated rhodamine (MeRho) bij een uiteindelijke concentratie in de gel van 20 nM) kan ook worden toegevoegd aan de eerste oplossing voor de patronen zichtbaar te maken, omdat het bij voorkeur op te nemen in radicaal verknoopte regio's van de gel (figuur 2 ). D. Cel Cultuur en Analyse Na de verknoping, duik gels in putten van een weefselkweek plaat met media voor incubatie-en-analyse (zie volgende stappen). Cellen kunnen worden gevisualiseerd voor de morfologie met behulp van licht microscopie (figuur 3, typisch, gesynthetiseerde hydrogels zijn transparant) en de levensvatbaarheid van het gebruik van een TL-live / dode vlekken kit (figuren 3 en 4). Kleuring voor cellulaire actine (bijv. rhodamine of fluoresceïne gelabeld phalloidin) en de kernen (bv, 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) kan worden uitgevoerd met behulp van standaard fixatie en permeabilisatie procedures (figuur 4) met de volgende procedure. Spoel bouwt 3X gedurende 5 min met PBS. Fix gels door incubatie in 1 ml 4% formaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Spoel bouwt 3X met blokkerende oplossing van 3% (w / v) BSA en 0,5% (w / v) Tween in PBS. Permeabilize membraan met 0,25% (w / v) Triton X in het blokkeren van oplossing voor 20 minuten. Spoel bouwt 3X met het blokkeren van oplossing. Vlek voor F-actine met 0,66 ug / ml FITC of rhodamine phalloidin in het blokkeren van oplossing voor twee uur bij kamertemperatuur. Spoel 3x met blokkerende oplossing. Vlek cellulaire kernen met behulp van 0,4 pl / ml DAPI in PBS gedurende 20 minuten. Spoel 3X met PBS. Visualiseer cellen met behulp van epifluorescerende of confocale microscopie. Proliferatie van cellen in gels wordt vaak beoordeeld aan de hand commercieel verkrijgbare testen (bijv. de totale DNA of biochemische inhoud). PicoGreen is een veelgebruikte en gevoelige fluorescente nucleïnezuur vlek voor de kwantificering van double-stranded DNA (Singer et al..). Cellen kunnen ook worden geteld en genormaliseerd op een eerste controle in met de visualisatie methoden beschreven in stap 2. Histologische coupes en kleuren kunnen ook worden gebruikt om cellen te visualiseren en vormde matrix. Het volgende protocol voor de uitdroging en snijden van 3D hydrogelen kan worden gebruikt om cross-sectionele plakken op glas dia's te verkrijgen: Fixatie en uitdroging Spoel exemplaar 3X in PBS. Fix voor 5 – 30 minuten in 4% paraformaldehyde. Spoel exemplaar 3X in PBS. Incubeer het monster in EtOH bij 25 ° C gedurende 1 uur bij elk van de volgende EtOH (v / v) concentraties in water (in volgorde): 50%, 70%, 95%, 95%, 100% (op dit punt, monsters 's nachts kan worden bewaard bij 25 ° C). Clearing en Infiltratie Transfer naar 100% Citrisolv gedurende 1 uur bij 25 ° C, gevolgd door een uur bij 65 ° C. Gesneden monsters in de helft met een scheermesje in een petrischaal zodanig dat de doorsnede van het monster wordt blootgesteld. Transfer naar 1:1 mengsel van Citrisolv / Micro-cut Paraffine gedurende 1 uur bij 65 ° C. Transfer naar 100% Micro-cut Paraffine gedurende 1 uur bij 65 ° C. 'S nachts over te dragen aan 100% Micro-cut Paraffine bij 65 ° C. Transfer naar 100% Micro-cut Paraffine gedurende 1-2 uur bij 65 ° C. Inbedding Positie model in peel-away mal met 100% paraffine. Plaats een kleine hoeveelheid wax in mould bed, en steek de twee helften van het monster met de doorsnede naar beneden. Van toepassing zijn top filter stuk Voeg extra wax om onder te duiken de top stuk en laat uitharden voor ~ 10 minuten. Overdracht inzetstukken tot 4 ° C koelkast, zodat exemplaar te harden 's nachts. Monster mag worden sectieed de volgende dag, meestal op 5-10 micrometer dikte per stuk met in de handel verkrijgbaar microtomen. Typisch de schil-away mal is verticaal gemonteerd tegen de microtoom podium, en handmatige controles worden gebruikt om de snijdikte, snijmachine en afstemming van het monster met het blad in te stellen. RNA-extractie Genexpressie kan ook kwantitatief worden beoordeeld (bijv. via real-time polymerase chain reaction (PCR)). Het protocol voor RNA-extractie uit 3D-hydrogels, een voorbeeld hieronder is weergegeven, is heel anders dan de veel eenvoudiger 2D geval. Label een gecertificeerd RNAse gratis eppendorfbuisje voor elke 3D-hydrogel en voeg 500 ul TRIzol ® reagens aan elke buis. Gebruik een stamper (weefsel molen) om handmatig slijpen van de hydrogelen totdat een heldere oplossing wordt verkregen. Zorg ervoor dat de verschillende slijpmachines worden gebruikt voor elke conditie. Vortex elk Eppendorf gedurende 20 seconden om de monsters te homogeniseren. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten in beslag dissociatie van nucleoproteïne complexen mogelijk te maken. Cool monsters op ijs gedurende 20 min. Voeg 200 ul (per ml TRIzol) chloroform aan elk monster en vortex. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Centrifugeer monsters op 12.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Breng de waterige fase (heldere toplaag) om nieuwe Eppendorf buisjes (het vermijden van grensgebied en lagere rood, fenol-chloroform fase). RNA blijft in de heldere waterige fase. Gangbare technieken voor RNA-isolatie en-opslag kan nu worden gebruikt. Na de RNA-extractie, commercieel verkrijgbare kits voor reverse transcriptase en real-time PCR worden vaak gebruikt in combinatie met enkele wijzigingen (Elisseff et al.., Strehin et al..). Representatieve resultaten: Zie afbeelding 2-4 (zoals genoemd in de bovenstaande protocollen) voor de representatieve resultaten van de visualisatie van photopatterned hydrogelen en de inkapseling van de cellen in gels. Figuur 1. Overzicht van de 3D-inkapseling procedure. Diagram stappen komen overeen met sectie-titels in de stapsgewijze protocollen. Figuur 2. Photopatterned hydrogel met behulp van sequentiële Michael-type naast dan radicaal polymerisatie. (A) Schematische voorstelling van photopatterning van een gedeeltelijk verknoopt hydrogel met integratie van een foto reactieve kleurstof. (B) Circle of (C) streep transparant masker patroon hyaluronzuur hydrogels. Methacrylated rhodamine (MeRho) is opgenomen alleen in regio's van de gel die werden blootgesteld aan licht. Schaal bars = 100 micrometer. Figuur 3. Visualisatie van cellen in 3D hydrogelen. Stamcellen gevisualiseerd via (a) lichtmicroscopie of (b) live (groen, Calceïne AM) en dode (rood, Ethidium homodimeer-1) kleuring 24 uur na de inkapseling van 1 miljoen cellen / ml in een hyaluronzuur hydrogel verknoopt door middel van een lichte gestart vrije radicalen mechanisme. Schaal bars = 100 micrometer. Figuur 4. Visualisatie van cellen in 3D hydrogelen. hMSCs gekleurd voor (a) levende cellen (Calceïne AM) of (b) cellulaire actine (rhodamine phalloidin) en de kernen (DAPI) vijf dagen na de inkapseling van 1 miljoen cellen / ml in een hyaluronzuur hydrogel verknoopt door middel van een Michael-type mechanisme ( met behulp van lijm hanger peptiden en bifunctionele proteolytisch afbreekbare peptide crosslinkers). Schaal bars = 100 micrometer.