Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки путем перепрограммирования человеческих фибробластов с Stemgent правам лентивирус TF Установить

1. Перепрограммирование Семенной BJ клеток при плотности 1 х 10 5 клеток на лунку 6-луночный планшет. Культуры клеток в 2 мл ростовой среды (450 мл EMEM дополнена с 50 мл ES квалифицированных ФБС, 5 мл 10 мМ без незаменимых аминокислот, 5 мл пенициллина / стрептомицина, 5 мл 200 мМ L-глютамина и 0,9 мл 55 мМ β -меркаптоэтанол) в течение ночи при температуре 37 ° С и 5% СО 2. В тот же день, начать подготовку пластин MEF подачи, добавив 0,1% желатина, разбавленным водой в 6 ячейках и инкубации в течение ночи при 37 ° С и 5% СО 2. После инкубации удалите среды от BJ клеток и добавить 2 мл питательной среде с 6 мкг / мл polybrene, 500 мкл hOct4-лентивирус, 50 ​​мкл hSox2-лентивирус, 50 ​​мкл hNanog-лентивирус и 50 мкл hLin28-лентивирус в каждую лунку . Осторожно пластины для обеспечения даже покрытие среды. Выдержите в течение ночи при 37 ° С и 5% СО 2. В тот же день, удалите 1 флакон CF-1 клеток MEF из жидкого азота и оттепель. Удалите жидкость с желатином лунок (см. шаг 1.2) и добавления ячеек MEF подачи при плотности 0,2 × 10 5 клеток / лунку. Общий объем одной скважины должно быть 2 мл клеток в питательную среду MEF (450 мл DMEM дополнена с 50 мл ФБС и 5 мл без незаменимых аминокислот). На следующий день, отделить BJ клеток с 0,05% трипсин / ЭДТА и центрифуге при 200 мкг в течение 5 минут. Аспирируйте средних и ресуспендируют в ростовой среде. Удаление среды из пластины MEF подачи (см. п. 1.4) и добавьте 2 мл / лунку BJ клеточной суспензии. Концентрации клеток должна быть примерно 5 х 10 4 клеток / лунку. Выдержите в течение ночи при 37 ° С и 5% СО 2. Замените среду 24 часов после повторного посева с человеческими ES / IPS культуре клеток средой (400 мл DMEM/F12 дополнен 100 мл сыворотки Нокаут Замена, 5 мл 10 мМ без незаменимых аминокислот, 5 мл 200 мМ L-глутамина, 0,9 мл 55 мМ β-меркаптоэтанола и 20 нг / мл человеческий рекомбинантный bFGF). Изменение среды каждые 24 часов в течение 7 дней. После семи дней, изменение средних MEF кондиционированной среды (см. раздел 2). 2. Подготовка MEF кондиционированной среды Семенной CF-1 MEF фидерных клеток на 2 х 10 5 клеток / лунку на 6 лунками в 2 мл среды роста MEF. Выдержите в течение ночи при 37 ° С и 5% СО 2. Изменение среднего человека ES / IPS культуральной среды клеток. Выдержите в течение ночи при 37 ° С и 5% СО 2. Сбор супернатант каждые 24 часов в течение четырех дней. Фильтры супернатанта через фильтр 0,22 мкм. Дополнение супернатант с 50 нг / мл bFGF. 3. плюрипотентных Выбор колонии и пассажи Выберите ES-подобные колонии и вновь семя в человека ES / IPS питательной среде с добавлением 10 мкМ Stemolecule Y27632 на культуре клеток блюда предварительно отобранный с МВ-1 клеток MEF подачи. Выдержите в течение ночи при 37 ° С и 5% СО 2. Изменение культуральной среды через каждые 24 часов в течение первых семи дней (без дополняя Stemolecule Y27632). После семи дней, изменение средних MEF кондиционированной среды (см. раздел 2 для подготовки). Мы продолжали пассирования клетки, пока они не показали типичной морфологии человека ES. 4. Иммуноцитохимическая Экспертиза плюрипотентности Маркеры Вымойте клетки мягко три раза PBS. Fix клеток с 500 мкл фиксатором в течение 20 минут при комнатной температуре. Вымойте клетки мягко три раза PBS. Блок неспецифического связывания с 500 мкл блокирующего буфера в течение одного часа при комнатной температуре. Инкубируйте клетки с 250 мкл конкретных первичных антител в течение ночи при 4 ° С (мы использовали TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4, Sox2, Nanog и Lin28 на 1:100 разведениях). Вымойте клетки мягко три раза PBS. Инкубируйте клетки с 250 мкл вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре, держась подальше от света (мы использовали антимышиного IgM Cy3 сопряжены, антимышиного IgG Cy3 сопряжены, козий анти-IgM крысы Cy3 сопряженной и козьего анти- Кролик Cy3 сопряженных в разведении 1:300). Вымойте клетки мягко три раза PBS. Добавить DAPI (конечная концентрация 1 мкг / мл) до последнего мыть и инкубировать 5 минут для визуализации ядер. Анализ клетки под увеличением. Часть 5: Представитель Результаты 1. Морфология Результаты: Человек фибробластов крайней плоти (BJ) клетки совместно с трансдуцированных Oct4, Sox2, Nanog и Lin28. Морфологические изменения наблюдались уже в 4-й день после трансдукции, и кластер клетки стали более плотно упакованы в день 17 (рис. 1). Колонии были вручную выбрал в день 25 и культивировали на CF-1 клеток MEF подачи. Для облегчения колонии плюрипотентных образования клеток после перепрограммирования, мы использовали Stemolecule Y27632, ROCK ингибитор, для первоначального посева ночь во время каждого прохода. плюрипотентных клеточных колоний с хорошей морфологией наблюдались после трех последовательных раундов колонии сбор и пассажей. 2. Экспрессия маркеров плюрипотентности: Для дальнейшего характеризуют изолированной камере плюрипотентных колоний, мы смотрели на наличие общих маркеров плюрипотентности выражается в ЭС клетки. Колонии выставлены сильные щелочной фосфатазы (AP) деятельности (рис. 2). Кроме того, иммуноцитохимия (МУС) был выполнен на колоний плюрипотентных ячейки с панели маркеров плюрипотентности-специфических антител, в том числе поверхностные маркеры TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 и SSEA-3, а также ядерных маркеров Oct4, Sox2 и Nanog. Изолированных колоний плюрипотентных были положительными для всех маркеров (рис. 3). ICC результаты показывают, что плюрипотентных клетках выставлены соответствующие плюрипотентности выражению маркер, демонстрируя, что эти плюрипотентных клетках напоминают недифференцированные клетки человека ES. Рисунок 1: Морфологические изменения трансдуцированных BJ клеток. Яркие образы области типичной колонией ячейки плюрипотентных образуются при () 4 дня и (Б) 17 дней после трансдукции. Рисунок 2: AP деятельности перепрограммировать BJ клеток. Три различных колонии окрашивали Stemgent щелочные Kit Окрашивание фосфатазы. Рисунок 3: клетки человека плюрипотентных выразить высокие уровни следующих ЭСК специфических маркеров: поверхностные маркеры TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 и SSEA-3, и ядерных маркеров 4 октября, Nanog и Sox2.