Очистка Конкретные популяции клеток путем флуоресцентной Активированный Сортировка Cell (FACS)

Перед началом процесса, следующие элементы должны быть собраны и подготовлены: Лед 15 мл конические пробирки для окрашивания клеток и 12 х 75 мм трубы потока для окрашивания одной возможности управления цветом. Окрашивание буфер: фосфатно-солевым буфером (PBS) + 3% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) Пипетки Fc блок (если требуется) и окрашивание антител. Антитела необходимо титровать для оптимального окрашивания. Компенсация бисером Подвеска буфера: сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS) + 25 мМ HEPES + 3% FCS Трипановый синий и гемоцитометра Сотовый фильтр (40 мкм нейлон) Коллекция трубок: два типа коллекции трубы могут быть использованы) 12 х 75 мм полистирола труб (содержащие 300 мкл FCS и 25 мМ HEPES) или б) 15 мл конические пробирки (с 1 мл ФТС + 25 HEPES мМ). Любая богатая среде с высокой концентрацией сывороточного могут быть использованы для сбора отсортированных клеток. Создание суспензии отдельных клеток исходной популяции клеток. Дополнительно: обогащайтесь на нужную ячейку населения по объемной метод очистки, такие как истощение дополнять или магнитной сортировки. Основным преимуществом обогащения шагом является то, что он снижает рода времени. Вымойте клетки сразу с окрашиванием буфера. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в окрашивании буфера при концентрации до 50 х 10 6 для эффективного окрашивания. Дополнительно: Для клеток, экспрессирующих высокие уровни FcR, блокировать рецепторы с помощью соответствующего метода блокирования. Методом выбора является использование МКА, которое связывается с FcγR на льду в течение 10-15 мин. Эти антитела имеются в продаже. Добавить соответствующие МАБ (в заданной концентрации), чтобы окрасить нужную ячейку населения и инкубировать в течение 20-30 минут на льду в темноте, а затем два промывок окрашивания буфера. Дополнительно: Окрашивание жизненно красителя, таких как пропидий йодид, могут быть включены разглядеть мертвые клетки (5). Если многоцветной окраски, которые будут использоваться, одного управления цветом обязательны для заполнения. Мы используем BD CompBeads подготовить единый контроль цвета с использованием протокола производителя. Если не используется непосредственно конъюгированных антител, повторите шаг 7, используя соответствующие вторичными антителами или стрептавидином сопряжены. После мытья ресуспендирования клеток в культуральной среде и определить концентрацию клеток использованием жизненно важных красителей, таких как Трипановый синий. Отрегулируйте концентрацию клеток до 15-20 х 10 6 / мл. Для популяции клеток, которые образуют кластеры, которые могут засорить инструмента в процессе сортировки, фильтрации клеток через сито. Настройка и оптимизация ячейки сортировщика. Процесс создания потока цитометр варьируется в зависимости от производства и потребностей, которые будет выполнять должным образом подготовленного персонала. Общие рекомендации таковы: Выберите соответствующий сопла в зависимости от типа клеток, которые необходимо отсортировать. Для стерильных сортов, стерилизации инструмента. Выполните инструмент контроля качества с бисером для проверки лазеры работают, и это сортировка точно. Установите необходимые устройства сбора и создать сторону потоков. Посмотрите на лазерных инструмента и детектор, созданный для определения флуоресцентных меток, которые могут быть использованы (наш BD FACS Aria имеет три лазера и может определить до девяти цветов). Как только будет установлено, что флуоресцентные метки будут использоваться на клеточной сортировщик, компенсации могут быть выполнены (как описано ниже). Выполните компенсацию с использованием отрицательного контрольного образца и одного положительного контроля. Компенсация необходимо снять спектр перекрытия между двумя детекторами. Уместно отметить, что компенсация не дурака и оказывает отрицательное влияние как ярко определенных маркеров пятно, и флуоресценции клеток, которые имеют низкую аутофлюоресценция что может привести к плохим разрешением между тусклыми и отрицательные населения. Для достижения наилучших результатов опытно-конструкторских должна включать в себя использование ярких флуорохромов с маркерами, которые имеют низкую экспрессию или которые не имеют известные окрашивания узор. Маркеры, которые обеспечивают хорошее разделение между клеточных популяций и высоко выразил следует использовать с димера флуорохромами такие, как те, возбуждаемые красного или фиолетового лазеров. Компенсация может быть выполнена с компенсацией бусы, которые полистирола микрочастиц, которые были связаны с антитела, специфичные для цепи Каппа свете Ig от мыши, крысы, крысы или / хомяка. Бисер легкозагрязнимыми, имеют надежный сигнал и обеспечивают простой способ приготовления одного окрашенных элементов управления, которые имеют те же флуорофора как экспериментальные образцы. Настройка шаблона, который включает в себя двумерный график для отображения рассеяния вперед (FSC) и бокового рассеяния (SSC), и один гистограммы длякаждый флуорохромом, который будет использоваться. Выполнить отрицательные трубки контролировать и регулировать рассеяния вперед (FSC) и бокового рассеяния (SSC) для размещения населения проценты по шкале. Настройка параметров флуоресценции ГУП место отрицательная населения или аутофлюоресценция в крайней левой стороны части гистограммы. Запись отрицательные трубки контроля. Выполните одно положительное труб контроля и учета данных для каждой трубки. Нарисуйте интервал ворот вокруг положительного часть данных на гистограмме, а другой интервал ворот на отрицательные части гистограммы. Руководство компенсации осуществляется путем изменения медианы (медиана более точную оценку среднего значения, чем среднее по логарифмической шкале) срабатываний пока он равен медиана негативов. Это должно быть сделано для каждого из флуорохромом этикетки, используемые в эксперименте. Для регулировки медиана, регулировать перекрытие спектральных значений выше или ниже до медианы для каждого матча флуоресцентного параметра как можно ближе. Компенсация может быть сделано автоматически с анализом программного обеспечения. Автоматическая компенсация использует записанные данные от возмещения контроля для вычисления алгебраических матрица для всех флуорофоров, используемых в эксперименте. Эти значения используются, чтобы вычесть из вкладов несырьевых цвета, которые являются кровоизлияния в детектор в основной цвет. Запись экспериментального образца должны быть отсортированы и использовании стробирования инструменты и подмножества методы для определения популяций интерес. Настройка шаблона с экспериментальной точки участка, который отображает ФСБ против SSC и использовании стробирования инструмент, многоугольник, прямоугольник, интервал или квадрант до ворот населения интерес. Точечная диаграмма отображает физические свойства клетки, которая отличается по типу клеток. Лучший способ определить стратегию стробирования флуоресценции заключается в использовании флуоресценции минус один (FMO) контроля. В трубке контроля FMO все реагенты, которые используются в эксперимент включены за исключением одного из интереса. FMO помогает различать тускло окрашенных населения и широкий негативный населения. Использование данных, записанных из труб FMO, чтобы определить, где разместить ворота в пределах экспериментальной трубки. Как только ворота были определены, ворота могут быть выбраны для сортировки во внешние трубы коллекции. До четырех ворот (или популяций) могут быть отсортированы в свое время в зависимости от аппаратуры доступны. Выполнить экспериментальные трубки образца при 4 ° С, включите отклоняющие пластины, и сортировать образца. 5 х 10 5 -1,5 х 10 6 клеток могут быть разделены на 12 х 75 мм, трубки и 1,5 х 10 6 – 4,5 х 10 6 клеток могут быть разделены на 15 мл конические. Как только необходимое количество клеток было получено, вручную остановить сортировки. Выполните после сортировки анализ для определения чистоты отсортированы клеточных популяций. Представитель результаты Мы показали здесь результаты для мыши селезенки B и CD4 Т-клеток сортировки (рис. 1). Спленоциты окрашивали PE Texas Red-сопряженных антимышиным B220, FITC-сопряженных антимышиным TCRβ и Alexafluor-700-сопряженных антимышиным CD4 для определения В-клеток (B220 + TCRβ-) и CD4 Т-клеток (CD4 + + TCRβ ). Сортировка была выполнена с BD FACS инструмент Aria. После сортировки B чистоты ячейки> 97%, а лимфоцитов CD4 T чистоты> 98%. Рисунок 1. Чистоту селезенки В-клеток и CD4 Т-клеток после FACS. Мышь спленоцитов окрашивали антимышиным B220, TCRβ и CD4 антител. FACS для клеток проводили с использованием BD FACS Aria от литниковой на B220 + TCRβ-клеток (рис. 1А, левая панель, правый нижний квадрант). Анализ сообщению рода была проведена для определения чистоты В-клеток (рис. 1А, правая панель). B220 окрашивания показана на оси х и TCRβ пятен на оси ординат. FACS для CD4 Т-клеток была выполнена с использованием тех же цитометр потока стробирования по TCRβ + CD4 + клеток (Рис. 1B, левая панель, правый верхний квадрант). Анализ сообщению рода была проведена для определения чистоты CD4 Т-клетки (рис. 1В, справа). TCRβ окрашивания показана на оси абсцисс и CD4 пятен на оси ординат. Процент позитивных клеток в каждом квадранте показано. <!– Рисунок 2. Чистоту селезенки CD4 Т-клеток после FACS. Селезенки мышей Т-клеток обогатились путем удаления В-клеток путем панорамирования. Впоследствии, клетки окрашивали антимышиным TCRβ и CD4 антител (слева). FACS проводили с использованием BD FACS Aria от литниковой на TCRβ + CD4 + клеток (левая панель, правый верхний quadrмуравьев). Анализ сообщению рода была проведена для определения чистоты Т-клетки, которых было больше, чем на 99% (правая панель). TCRβ окрашивания показана на оси абсцисс и CD4 пятен на оси ординат. Процент позитивных клеток в каждом квадранте показано. ->