Purificazione della popolazione di cellule specifiche per fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS)

Prima di avviare il processo, i seguenti elementi devono essere raccolte e preparate per: Ghiaccio Provette da 15 ml per le cellule colorazione e 12 x 75 mm per tubi di flusso colorazione controlli singolo colore. Colorazione buffer: tampone fosfato salino (PBS) + 3% di siero fetale bovino (FCS) Pipette Fc bloccare (se necessario) e gli anticorpi colorazione. Gli anticorpi devono essere titolati per la colorazione ottimale. Compensazione perline Buffer di sospensione: soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) + 25 HEPES mM + 3% FCS Trypan blu e emocitometro Cellule filtro (40 micron nylon) Provette per la raccolta: due tipi di tubi di raccolta può essere utilizzato a) 12 x 75 tubi in polistirolo mm (contenente 300 ml di FCS e 25 HEPES mM) o b) 15 ml provette coniche (FCS contenente 1 ml + 25 HEPES mM). Qualsiasi mezzo ricco di alta concentrazione sierica può essere utilizzato per la raccolta di cellule ordinati. Generare una sospensione singola cella della popolazione di cellule di partenza. Opzionale: Arricchire per la popolazione cella desiderata con un metodo di purificazione di massa quali la riduzione del complemento o di smistamento magnetico. Il vantaggio principale della fase di arricchimento è che riduce il tempo di sorta. Lavare le cellule una volta con colorazione buffer. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in colorazione tampone ad una concentrazione fino a 50 x 10 6 per la colorazione efficiente. Opzionale: Per le cellule che esprimono alti livelli di FCR, bloccare i recettori utilizzando un metodo appropriato di blocco. Un metodo di scelta è l'utilizzo di un anticorpo monoclonale che si lega a FcγR in ghiaccio per 10-15 minuti. Questi anticorpi sono disponibili in commercio. Aggiungere la appropriato mAb (a una concentrazione predeterminata) per colorare la popolazione cella desiderata e incubare per 20-30 minuti sul ghiaccio al buio, seguito da due lavaggi con tampone colorazione. Opzionale: colorazione con un colorante vitale, come lo ioduro di propidio, possono essere usate per discernere le cellule morte (5). Se multicolore colorazione deve essere utilizzato, i controlli solo colore sono obbligatori. Noi usiamo CompBeads BD per preparare i controlli singolo colore utilizzando il protocollo del produttore. Se non si utilizza direttamente gli anticorpi coniugati, ripetere il punto 7 con l'anticorpo secondario appropriato o coniugato streptavidina. Dopo il lavaggio, risospendere le cellule in terreno di coltura e determinare la concentrazione di cellule utilizzando un colorante vitale come tripan blu. Regolare la concentrazione cellulare a 15-20 x 10 6 / ml. Per le popolazioni di cellule che formano i cluster, che possono ostruire lo strumento durante l'ordinamento, filtrare le cellule attraverso un colino. Impostare e ottimizzare la cell sorter. Il processo di creazione di un citofluorimetro varia a seconda della produzione e deve essere eseguita da personale adeguatamente addestrato. Le raccomandazioni generali sono i seguenti: Selezionare l'ugello appropriato a seconda del tipo di cellula da ordinare. Per i tipi sterile, sterilizzare lo strumento. Effettuare il controllo della qualità dello strumento con perline di verificare i laser funzionano, ed è l'ordinamento con precisione. Installare il dispositivo richiesto raccolta e impostare i torrenti laterali. Guarda laser dello strumento e il rivelatore fissati per determinare le etichette fluorescenti che possono essere utilizzati (il nostro BD FACS Aria ha tre laser e in grado di rilevare fino a nove colori). Una volta determinato ciò etichette fluorescenti saranno utilizzati sul cell sorter, la compensazione può essere effettuata (come spiegato di seguito). Eseguire compensazione con il campione di controllo negativo e positivo i controlli singoli. La compensazione è necessario rimuovere la sovrapposizione dello spettro tra due rivelatori. E 'il caso di osservare che la compensazione non è infallibile ed è influenzata negativamente da come brillantemente alcuni marcatori macchia, e con la fluorescenza delle cellule che hanno autofluorescenza basso, che può portare ad una risoluzione molto bassa tra le popolazioni debole e negativo. Per ottenere i migliori risultati, il disegno sperimentale dovrebbe includere utilizzando fluorocromi luminoso con marcatori che hanno una bassa espressione o che non hanno un pattern di colorazione nota. Marcatori che garantiscono una buona separazione tra le popolazioni delle cellule e sono altamente espresso deve essere usato con fluorocromi dimero come quelli eccitati dal laser di colore rosso o viola. Compensazione può essere eseguita con perline di compensazione, che sono microparticelle di polistirene che è stato accoppiato ad un anticorpo specifico per la catena leggera Kappa di Ig di topo, ratto o topo / criceto. Le perle sono facili da macchia, un segnale forte e forniscono un modo semplice di preparare singoli controlli che hanno macchiato il fluoroforo stesso i campioni sperimentali. Impostare un modello che include un complotto bivariata per visualizzare scatter in avanti (FSC) e side scatter (SSC), e uno istogramma perogni fluorocromo che verrà utilizzato. Esegui il tubo di controllo negativo e regolare la dispersione in avanti (FSC) e side scatter (SSC) per posizionare la popolazione di interesse su scala. Regolare le impostazioni PMT fluorescenza per posizionare la popolazione negativo o autofluorescenza nella porzione mano all'estrema sinistra dell'istogramma. Registra il tubo di controllo negativo. Eseguire i tubi singolo controllo positivo e registrare i dati per ogni tubo. Disegnare un cancello intervallo intorno alla parte positiva dei dati sul istogramma, e un altro cancello intervallo sulla porzione negativa dell'istogramma. Compensazione manuale viene effettuata regolando la mediana (mediana è una stima migliore della tendenza centrale rispetto alla media su una scala logaritmica) dei positivi fino a quando non è uguale alla media dei negativi. Questo deve essere fatto per ciascuna delle etichette fluorocromo utilizzato nell'esperimento. Per regolare la mediana, regolare i valori spettrali si sovrappongono sia superiore o inferiore fino a quando le mediane per ogni partita parametro fluorescente il più possibile. Compensazione può essere effettuata anche automaticamente con il software di analisi. Compensazione automatica utilizza i dati registrati dai controlli di compensazione per calcolare una matrice algebrica di tutti i fluorofori utilizzati nell'esperimento. Questi valori vengono utilizzati per sottrarre i contributi dei non-colori primari che sono il sanguinamento in rivelatore di un colore primario. Registrare il campione sperimentale da ordinare e utilizzare strumenti e metodi di sottoinsiemi gating per definire le popolazioni di interesse. Impostare il modello sperimentale con un dot plot che mostra FSC vs SSC e utilizzare uno strumento di gating, poligono, rettangolo, intervallo o al quadrante porta la popolazione di interesse. Il grafico a dispersione visualizza le proprietà fisiche della cellula che è distinto per il tipo di cellula. Il modo migliore per determinare la strategia di fluorescenza gating è quella di utilizzare fluorescenza meno uno (FMO) controlli. In una provetta di controllo FMO tutti i reagenti utilizzati nell'esperimento sono inclusi ad eccezione di quello di interesse. La FMO aiuta a discriminare tra le popolazioni scarsamente colorati e ampia popolazioni negativo. Utilizzare i dati registrati da tubi FMO a determinare la posizione cancelli all'interno del tubo sperimentale. Una volta che cancelli sono stati determinati, le porte possono essere selezionati per l'ordinamento in tubi di raccolta esterni. Fino a quattro porte (o popolazioni) possono essere ordinati in una sola volta a seconda della strumentazione disponibile. Esegui il tubo sperimentale campione a 4 ° C, girare su piatti di deflessione, e ordinare il campione. 5 x 10 5 -1,5 x 10 6 cellule possono essere ordinati in un tubo di 12 x 75 mm e 1,5 x 10 6 – 4,5 x 10 6 cellule possono essere ordinati in un ml 15. Una volta che il numero di cellule è stata ottenuta, interrompere manualmente l'ordinamento. Eseguire una sorta di post-analisi per determinare la purezza delle popolazioni cellulari ordinati. Rappresentante risultati Abbiamo mostrato qui i risultati per B del mouse splenica e l'ordinamento delle cellule T CD4 (Figura 1). Splenociti sono state colorate con PE Texas Red-coniugato anti-topo B220, FITC-coniugato anti-topo TCRβ e Alexafluor-700-coniugato anti-topo CD4 per identificare le cellule B (B220 + TCRβ-) e le cellule T CD4 (CD4 + + TCRβ ). La selezione è stata effettuata con lo strumento BD FACS Aria. Dopo la cernita la purezza delle cellule B era> 97% e la purezza delle cellule T CD4 era> 98%. Figura 1. La purezza delle cellule B della milza e le cellule T CD4 dopo FACS. Splenociti topo sono state colorate con anticorpi anti-topo B220, TCRβ e anticorpi CD4. FACS per le cellule B è stata effettuata utilizzando un BD FACS Aria di gating su B220 + TCRβ-cellule (Fig. 1A, pannello di sinistra, quadrante in basso a destra). Una sorta di analisi post è stato eseguito per determinare la purezza delle cellule B (Fig. 1A, pannello di destra). Colorazione B220 viene visualizzato l'asse delle ascisse e colorazione TCRβ sulla y.. FACS di cellule T CD4 è stata eseguita con lo stesso citometro di flusso di gating su TCRβ + cellule CD4 + (Fig. 1B, pannello di sinistra, quadrante superiore destro). Una sorta di analisi post è stato eseguito per determinare la purezza delle cellule T CD4 (Fig. 1B, pannello di destra). Colorazione TCRβ viene visualizzato l'asse delle ascisse e CD4 macchie sulla y.. Le cellule positive per cento in ogni quadrante viene visualizzato. <!– Figura 2. Purezza delle cellule T CD4 splenica dopo FACS. Murini cellule T della milza sono stati arricchiti con la rimozione delle cellule B di panning. Successivamente, le cellule sono state colorate con anticorpi anti-topo TCRβ e anticorpi CD4 (pannello di sinistra). FACS è stata effettuata utilizzando un BD FACS Aria di gating su TCRβ + cellule CD4 + (pannello di sinistra, in alto a destra quadrformica). Una sorta di analisi post è stato eseguito per determinare la purezza delle cellule T, che è stato superiore al 99% (pannello di destra). Colorazione TCRβ viene visualizzato l'asse delle ascisse e CD4 macchie sulla y.. Le cellule positive per cento in ogni quadrante viene visualizzato. ->