يوضح هذا البروتوكول بسيطة المجهري مضان المفرد جزيء تقنية لتصور تكرار الحمض النووي التي replisomes الفردية في الوقت الحقيقي.
وصفنا بسيطة مضان المجهري المستندة في الوقت الحقيقي لمراقبة طريقة تكرار الحمض النووي على مستوى واحد جزيء. ومرفق بهذا التعميم ، قالب الحمض النووي متشعب إلى ساترة functionalized الزجاج على نطاق واسع وتكرارها بعد إدخال البروتينات النسخ والنيوكليوتيدات (الشكل 1). يتم توسيع المتزايد الناتج المزدوج حبلا الحمض النووي (dsDNA) مع تدفق الصفحي وتصور باستخدام صبغة الإقحام. قياس موقف نهاية الحمض النووي المتنامي في الوقت الحقيقي يسمح التحديد الدقيق لمعدل التكرار (الشكل 2). وعلاوة على ذلك ، وطول الحمض النووي الانتهاء من المنتجات تقارير عن processivity من تكرارها. يمكن إجراء هذه التجربة بسهولة وبسرعة جدا ويتطلب سوى مضان المجهر مع كاميرا حساسة إلى حد معقول.
المراقبة الحرجة واحد هو دراسة تأثير أورانج SYTOX صمة عار ، على البروتينات تكرار الفائدة. وهناك طريقة بسيطة للقيام بذلك هي لتنفيذ تكرار التجربة في الخلية التدفق كما هو موضح ولكن مع إغفال SYTOX. بعد خليط التفاعل قد تدفقت عبر الغرفة ، إضافة إلى SYTOX العازلة مع وصمة عار الحمض النووي ودراسة توزيع طول جزيئات منسوخة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام معظم ردود الفعل القياسية لفحص أي تأثير على معدل تكرار SYTOX والكفاءة.
التجربة الموصوفة هنا فقط يستخدم تدفق قناة واحدة. يمكن تغيير هذا بسهولة من خلال خلق قنوات متعددة الغرف تدفق أو استخدام أو الأجهزة ميكروفلويديك PDMS مماثلة. زيادة عدد القنوات ييسر فحص تركيزات البروتين ، والمسوخ ، أو الجزيئات المانع ويزيد من سرعة جمع البيانات تكرارها.
كما ذكرنا ، فإننا أداء E. تكرار التجارب القولونية عند 37 درجة مئوية باستخدام تدفق الالومنيوم تدفئة المنازل بنيت الخلية ، عنصر التدفئة مقاوم (خرطوشة سخان) والمتغير امدادات الطاقة. وهذا يعطي درجة حرارة جيدة الاستقرار والابتعاد عن شراء سخان الهدف. لمعايرة جهاز التدفئة ، ونحن ببساطة حفر حفرة في وسط تدفق رأس خلية الكوارتز ، وإدراج الحرارية في قناة تدفق وتدفق العازلة كالمعتاد. قياس درجة حرارة التدفق العازلة خلية في زيادة الفولتية يسمح التدفئة دقيقة.
سمير حمدان ساعد في تطوير هذه التقنية. E. البروتينات القولونية هي من مختبر البروفيسور نيك ديكسون ، جامعة ولونغونغ ، والبروتينات هي من T7 البروفيسور تشارلز ريتشاردسون ، كلية هارفارد الطبية. وتدعم العمل الذي قامت به المعاهد الوطنية للصحة (GM077248 لAMvO) والتابوت جين تشايلدز مؤسسة (JJL).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
M13mp18 ssDNA | New England Biolabs | N4040 | ||
Biotinylated Tail Oligo | Integrated DNA Technologies | |||
T7 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0274 | Use T7 replication buffer for substrate preparation | |
Phenol/ Isoamyl Alcohol/ Chloroform | Roche | 03117987001 | 24:24:1 v/v | |
3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma | A3648 | Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces | |
Succinimidyl propionate PEG | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
Biotin-PEG-NHS | Nektar | |||
Double-sided tape | Grace BioLabs | SA-S-1L | 100 μm thickness | |
Quartz slide | Technical Glass | 20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H) |
Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net) | |
Polyethylene tubing | Becton Dickinson | 427416 | 0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted. |
|
Streptavidin | Sigma | S4762 | Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3 | |
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix | New England Biolabs | N0447 | ||
Ribonucleotide triphosphate solutions | Amersham | 272056 272066 272076 272086 |
||
SYTOX Orange | Invitrogen | S11368 | Other dsDNA stain can be used | |
Fluorescence Microscope with 60x TIRF objective | Olympus | IX-71 | Microscope, camera, etc. can be substituted for similar equipment | |
Syringe Pump | Harvard Apparatus | 11 Plus | Operate in refill mode to facilitate solution changes | |
532 nm laser | Coherent | Compass 215M-75 | Select wavelength to correspond to stain of choice | |
EMCCD Camera | Hamamatsu | ImagEM | ||
Emission filter | Chroma | HQ600/75m |
T7 Replication: 40 mM Tris pH 7.5, 50 mM potassium glutamate, 10 mM magnesium chloride, 100 μg/mL BSA, with 5 mM dithiothreitol, 600 μM dNTPs, 300 μM ATP, 300 μM CTP, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 5 nM gp4 (hexamer), 40 nM polymerase (1:1 gp5: thioredoxin), 360 nm gp2.51,5.
E. coli Replication: 50 mM HEPES pH 7.9, 12 mM magnesium acetate, 80 mM potassium chloride, 100 μg/mL BSA with 10 mM dithiothreitol, 40 μM dNTPs, 200 μM rNTPs, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ2γ1δδ’χψ or τ3δδ’χψ, 30 nM β (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT1,6