הכנה והתרבות של עדשה Explants עכברוש אפיתל ללימוד בידול Terminal
Summary
Explants האזור המרכזי של עכברוש העדשה epithelia להבדיל סינכרוני כאשר בתרבית בנוכחות של FGF-2. מיקרוסקופיה immunofluorescence של תרבויות כאלה יכולים מספק מידע רומן על ביטוי גנים ואירועים איתות הקשורים בידול סופנית.
Abstract
המשטח הקדמי של עדשת העין מכוסה בשכבה של תאים אפיתל, אשר מתרבים באזור טבעתי שבבסיס גוף ריסי. בעקבות החלוקה, תאים אלו נודדים בדיעבד, שם FGF לשדר מן הרשתית גורמת להם להתמיין למגוון האחורי של סיבים מאורכים תאים העדשה, אשר מהווים את חלק הארי של העדשה. התמיינות של תאים אפיתל העדשה לתוך סיבי העדשה יכול להיגרם על ידי במבחנה explants culturing האזור המרכזי של האפיתל הקדמית בנוכחות של FGF-2. Explants מוכנים מן העדשות של חולדות הילוד על ידי הסרת העדשות מהעין ו לתפוס את הקפסולה העדשה בצד האחורי עם פינצטה לנתח. קפסולה אחורית אז הוא נקרע בעדינות לפתוח ולחצתי לתחתית צלחת פלסטיק של תרבית רקמה. אזורי הפריפריה של explant מוסרים עם אזמל והאזור המרכזי בתרבית ואז בנוכחות 100ng/ml FGF-2 עוד 2-3 שבועות, תלוי בפרמטרים כדי להיחקר. מכיוון שתאי האפיתל explants תרבותי להבחין בתיאום המשוער לאורך תקופה של ימים עד שבועות, במהלך תקופה של איתות ביטוי גנים ניתן לקבוע תוך שימוש בטכניקות מולקולריות, ביוכימיות, וגם תרופתי. מיקרוסקופיה immunofluorescence הוא נספח חזק בשיטות אלה כפי שהוא מדגים את subcellular לוקליזציה של חלבונים עניין יכול לחשוף את ההשלכות הפיזיולוגיות של מניפולציות ניסיוני של מסלולי איתות.
Protocol
Discussion
העדשה עכברוש מערכת explant שימש בהצלחה על ידי מספר מעבדות מחקר בידול הטרמינל של תאים אפיתל העדשה לסיבי העדשה 21,3,4,5. כאשר נחשף FGF-2 ב 100ng/ml explants יתחיל להראות שינויים איתות בתוך 6 דקות, עם שינויים במורפולוגיה ועל ביטוי גנים המופיעים ברצף במשך כמה ימים 3,4,5. תרבויות נשארים קיימא עבור 2-3 שבועות אם הטיפול נלקח על מנת למנוע זיהום.
Explants המרכזי המתואר פרוטוקול זה שימושי במיוחד עבור לומדים את רצף האירועים הקשורים הבחנה, מכיוון שהם מכילים מעט אם בכלל תאים המבטאים סמנים בידול לפני FGF-2 הוא הוסיף 1,5. התאים אז להבדיל סינכרוני, כמו במדגם, כך שניתן לעקוב אחר מהלך הזמן של איתות תעתיק אירועים הקשורים בידול. Explants culturing עבור זמן שונים ובכך מספק מידע מדויק על זמני רצף האירועים. מעכבי ספציפיים ניתן להוסיף בינוני התרבות לזהות איתות המסלולים הרלוונטיים. Explants ניתן להשתמש כדי לנתח את ביטוי החלבון על ידי אלקטרופורזה בג'ל SDS ו immunoblotting או לנתח את הביטוי של mRNAs ספציפי על ידי RT-PCR. התשואות חלבון בטווח 20-50 מיקרוגרם / explant ואת התשואה RNA הוא כ 200-600 ng / explant, בהתאם לאורך התקופה והתרבות. בדרך כלל אנחנו מוצאים 5-6 explants לכל צלחת תספק מספיק חלבון או רנ"א עבור מבחני מספר. RNA מן explants יכול לשמש גם כדי להכין cDNA להערכת ביטוי גנים על ידי ניתוח microarray, אשר יכול לזהות גנים הרומן הזה יכול להיות קריטי עבור בידול. Explants יכול להיות גם transfected. למרות היעילות transfection הוא בדרך כלל נמוך, זה מספיק עבור assaying גנים כתב 4, 7, 8. מיקרוסקופיה immunofluorescence של explants מספק נלווה שימושי בשיטות ביוכימיות על ידי קביעת מיקום subcellular של חלבונים של עניין. לפיכך, הכנת והתרבות של explants העדשה עכברוש מספק מערכת רבת עוצמה ללימוד העדשה בידול מסוף ביונקים, אשר יכול להשלים בטכניקות vivo, כמו הדור של העכברים הטרנסגניים ו עקום החוצה.
Acknowledgements
הכנה של explants העדשה אפיתל הותאם משיטות שמקורם במעבדה של ד"ר ג'ון McAvoy 9. עבודה זו ממומנת על ידי המוסד Eye Institute, תוכנית המחקר עירונית Z01-EY000238-22
References
- McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration. Development. 107 (2), 221-228 (1989).
- Campbell, M. T., McAvoy, J. W. Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium. Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).
- Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF). Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).
- Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling. J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).
- Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation. Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).
- Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling. Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).
- Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene. Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).
- Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin. The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).
- McAvoy, J. W., T, V. Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants. Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).
