Preparación y Cultura de la lente explantes Rata epiteliales para el estudio de la diferenciación terminal

Parte 1: La eliminación de las lentes Materiales y reactivos: Micro-Tijeras de disección, puntas curvas, romas, (por ejemplo as.RS-5983, Roboz quirúrgica Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD), micro-disección pinzas, punta curva (como Roboz # RS5137). Medio de suspensión: Medio 199 conteniendo 0,1% de albúmina de suero bovino, 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 100μg/ml, 2,5 mg / ml Reactivos anfotericina B. están disponibles a partir de Invitrogen, Carlsbad, CA. Procedimiento: La eutanasia a las ratas recién nacidas (de 2-4 días), de conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD. Eliminar los párpados con una tijera quirúrgica. Presione suavemente con unas pinzas curvas en los lados opuestos de la órbita del ojo para forzar el ojo pared hacia afuera. Haga una pequeña incisión en la parte posterior del ojo con las tijeras. Pulsando con pinzas contra el lado del ojo frente a la incisión, la lente y una pequeña cantidad de vítreo adjunta a continuación, se puede forzar a través de la ruptura, lo que permite la lente para ser recogidos con pinzas curvas. Se debe tener cuidado de no romper la cápsula del cristalino. Utilice las pinzas curvas para la transferencia de las lentes de 60 mm a un plato de plástico de 5 ml de cultivo de tejidos que contienen medio caliente, suspensión estéril. Parte 2: Microdisección de explantes Materiales y reactivos: Micro pinzas de disección, 0,1 mm de consejos, (como Roboz RS-4976). Usamos aleación Dumostar debido a la flexibilidad de la punta, pero otras aleaciones de acero también son aceptables. Pinzas con puntas de 0,1 mm más delgado que no son recomendables, ya que tienden a romperse o doblarse durante este procedimiento. Suspensión medio (véase la Parte 1) Sin suplementar F12 de Ham o medio 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) Procedimiento: Los siguientes pasos deben realizarse en un lugar limpio, sin corrientes de aire ambiente utilizando herramientas de disección estéril y medio estéril. Utilizando un microscopio de disección estéreo, limpiar las lentes de los tejidos adheridos con la punta de pinzas 0,1 mm y transferirlos a una placa de cultivo con medio segundo de 60 mm 5 ml de suspensión estéril (este paso ayuda a reducir la contaminación). Con las pinzas, la transferencia de la cantidad deseada de lentes para una placa de cultivo de 35 mm que contiene 5 ml medio estéril, sin suplemento. (A menudo utilizamos F12 de Ham (Invitrogen) para este paso, porque la concentración de colorante más baja hace una disección más fácil, sin embargo, Medio 199 también es aceptable ningún antibiótico o cualquier otro tipo son necesarias en este paso..) Hasta 12 explantes se puede hacer en el centro de un plato de este tamaño. Sin embargo, un plato de 35 mm se debe utilizar, aunque menos explantes se deben hacer, ya que las herramientas de disección no se puede manipular con facilidad en un plato más pequeño. La transferencia de la cápsula que contiene las lentes restantes a un cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C hasta que se necesiten. Identificar la parte posterior de la lente. Hay muchas maneras de reconocer esto: 1) La parte posterior es más redonda que la anterior, que es ligeramente achatada, 2) las lentes de recién nacidos de ratas forman cataratas en frío cuando se enfrían a temperatura ambiente durante la disección. Si la catarata fría no ha llenado completamente el objetivo, la parte posterior es la parte más alejada de la zona opaca. Si la opacidad ha llenado la lente, el calentamiento de la placa a 37 ° C durante unos minutos lo contrario. El lado posterior se puede identificar como las reformas de cataratas en la refrigeración. 3) Los vestigios de la túnica vascular del cristalino pueden ser visibles en la parte posterior. 4) La sutura posterior puede ser visible en la parte posterior. La identificación de la parte posterior correctamente es esencial, ya que es donde la cápsula se abrió. Apertura de la lente en la parte anterior se rompa el epitelio. Una vez que la parte posterior se ha identificado, que a su vez hacia arriba y captar el lente de las pinzas de la izquierda (para un trabajador de la derecha). A continuación, una pizca de la cápsula posterior con las pinzas adecuadas para producir un pequeño pliegue. Mientras mantiene la cápsula posterior con las pinzas derecha, sujete la tapa de la cápsula con las pinzas a la izquierda y tirar de los dos pares de pinzas en direcciones opuestas para hacer un pequeño desgarro en la cápsula. Mientras sujeta el borde de la cápsula retráctil con las pinzas, tire de él hacia abajo, primero en un lado y luego por la otra, presionando en el plástico de la cápsula con las pinzas. Repita esto varias veces, moviendo todo alrededor del ecuador de la lente, hasta que la cápsula esté bien conectado a la placa en muchos puntos. De la cápsula en su lugar con las pinzas de la izquierda, agite suavemente la masa de las fibras con las pinzas derecho de romper la unión entre las células de las fibras y células epiteliales en el ecuador del cristalino. Luego empuje la masa de fibra de distancia, rodar fuera de la cápsula / epitelio, que permanece unido a la parte inferior de laplato. Continuar este proceso con todos los objetivos en el plato. Retire y deseche las masas de fibra (o guardarlos congelados como fuente de proteínas del cristalino para otros estudios). Parte 3: Microdisección y la cultura de los explantes centrales Materiales y reactivos: Desechable estéril de bisturí, hoja n. º 15, (Cincinnati quirúrgica Co. Cincinnati, OH) Fosfato de solución salina estéril tamponada con calcio y magnesio (Invitrogen, Carlsbad, CA) Medio de cultivo: medio de suspensión que contiene 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc. de St. Louis, MO). Procedimiento: Con un bisturí estéril, recortar el epitelio periférico (PE), que contiene las células en las primeras etapas de diferenciación (Figura 1), dejando una plaza central alrededor de 2,0 mm de lado, que consiste en el centro de las células epiteliales sólo (CE) (Figura 1B). Transferir el plato que contiene los explantes central para un gabinete de bioseguridad. Lavar 3 veces con PBS estéril que contiene calcio y magnesio, y una vez con 1 ml de medio fresco, equilibrado y suspensión (37 ° C CO, 5% 2). Estas soluciones reducen en gran medida la probabilidad de contaminación. Añadir 2 ml de medio de cultivo para inducir la diferenciación de una, y el lugar de los explantes en un humidificado, cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2. Períodos de la cultura puede ser tan corto como unas pocas horas o extenderse hasta dos o tres semanas, dependiendo del parámetro en estudio. Medio debe ser cambiado cada dos o tres días. Parte 4: La recolección de los explantes para el análisis de los acontecimientos relacionados con la diferenciación 1. Explantes de recolección para el análisis de proteínas o ARN Materiales: Pinzas Microdissecting Tampón de lisis SDS o ARN más tarde- Procedimiento: Al final del período de incubación, se elimina el medio de cultivo. Con el microscopio de disección estéreo, extraiga con cuidado los bordes de cada explante. Levante cada explante con las pinzas y transferirlo a un tubo que contiene buffer de lisis SDS 100μl (para el análisis de proteínas) o ARN más tarde (para el análisis de ARN). Agite la punta de las pinzas en la solución para asegurar que el explante no se pegue a las pinzas. 2. Explantes de la cosecha de inmunofluorescencia Materiales y reactivos: Tampón fosfato salino con calcio y magnesio (Invitrogen, Carlsbad, CA) Tampón fosfato salino (sin calcio y magnesio) (Invitrogen, Carlsbad, CA) Paraformaldehído al 4% (Bioproducts Boston, Worcester, MA) Pinzas Microdissecting Pluma hidrofóbicas marca Portaobjetos de vidrio 0,25% de Triton X-100 en tampón fosfato salino. Procedimiento: Enjuague explantes brevemente en PBS que contenía calcio y magnesio. Para reparar tejidos mediante la adición de 4% de paraformaldehído durante 30 minutos a temperatura ambiente. Retire el fijador y reemplazar con tampón fosfato salino. Explantes se fija un poco rígida, lo que les permite ser levantado y trasladado a las diapositivas de cristal para inmunotinción. Coloque una pequeña gota de PBS (sin calcio y magnesio) en la diapositiva para ayudar a posicionar el tejido y evitar que se ondulen. Con unas pinzas microdissecting, levante el explante y la inserta en la caída en la diapositiva. Sin tocar el explante, retire con cuidado el líquido con una mecha de papel para aplanar el explante en el cristal y dejar que el tejido seco en el aire a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos. Figura 1 A. El epitelio periférico expresa una diferenciación específica de las proteínas. El explante mostró fue immunostained para N-cadherina inmediatamente después de microdisección. Expresión se ve en una banda de células en el epitelio periférico, lo que indica que las células de esta región han empezado a diferenciarse. B. El epitelio periférico puede ser recortada para eliminar las células que expresan N-cadherina y otras proteínas de diferenciación específica. El anillo de color rojo representa la ubicación de las células que expresan N-cadherina, mientras que la pequeña plaza que se indica en gris representa el cuadrante del epitelio muestra en el panel 1A. El epitelio periférico puede ser removido por cuatro cortes de bisturí, dejando una plaza central que contiene las únicas células que todavía no han empezado a diferenciarse.