마우스 망막 신경절 세포의 유전자 발현에 대한 utero 및 전직 생체내의 Electroporation에

1 부 : utero 및 예 생체내 망막 electroporations에 대한 설정 1. utero 및 전직 생체내 망막 electroporations에 모두 세부적으로 밀고 micropipettes을 준비하고 직각 지점을 만들기 위해 팁 (또는 베벨 팁)을 깰 전극 풀러를 사용하십시오. 원하는 농도로 DNA 솔루션을 준비하고 주사를 시각화하기 위해 빠른 그린 염료 (0.05 %)의 소량을 추가합니다. 나는 utero 망막 electroporations에 대한 어머니 당 5 μl DNA 솔루션과 전 생체내 망막 electroporations에 대한 배아 인당 1 μl DNA 솔루션을 권장합니다. transfected 뉴런을 시각화하기 위해 GFP 표현 구조를 (또는 다른 형광 단백질) 포함합니다. 압력솥을 통해 수술기구를 소독. 100 μg / ML의 300ml의 1.0:0.2:4.6 용적 비율 : 100 μg / ML의 xylazine : 호수 아래의 비율 (각각의 임신 여성을위한 ~ 0​​.2 ML 만들기)와 마취제 – xylazine 마취 믹스를 준비합니다. 다른 anesthetics을 사용할 수 있습니다. 2. utero 망막 electroporations에 대해서만 가열 패드의 전원을 켜고 기저귀 패드로 커버. 인산염 버퍼 생리 (PBS)와 가열 패드에 따뜻한에서 항생제 – antimycotic 솔루션 (1:100)을 준비합니다. 각 댐에 대해 ~ 2 ML을 준비합니다. 온수 욕조에서 멸균 필터링 PBS를 놓습니다. 3. 예 생체내 망막 electroporations에 대해서만 95 % 산소 / ≥ 2 시간 동안 5 % 이산화탄소와 버블 DMEM/F12 25 ML : 망막 보육에 대한 산소 혈청 무료 미디어 (SFM)을 준비합니다. 25 ML 산소 매체, 0.25 g 소 혈청 알부민 (BSA), 250 μl ITS 보완 및 50 μl 페니실린 – 스트렙토 마이신 솔루션을 추가합니다. 무균 필터 다음 솔루션을 BSA를 해산하기 위해 솔루션을 섞는다. 이 솔루션은 각 electroporation 실험에 대한 신선한하여야한다. 압력솥 저어 자석과 150 ML 병의 메틸 셀룰로오스의 0.20 g : 망막 explant 보육을위한 SFM + 0.4 %의 메틸 셀룰로오스 매체를 준비합니다. SFM (위, 버블링하지 않고) 50 ML을 준비하고 autoclaved 메틸 셀룰로오스 술병에 추가할 수 있습니다. 4 ° C 하룻밤에이 솔루션을 섞는다. 무균 필터가이 솔루션은 4 다음 날 및 저장 ° C,이 솔루션은 ~ 1 달 동안 보관하실 수 있습니다. 망막 explant의 수확 (5 부)의 날, 망막 explant 도금을위한 요리를 준비 : 코트 유리 바닥 문화 요리 폴리 – L – ornithine 250 μl와 ≥ 2 시간 동안 37 ° C.를 (또는, 요리는 전날 폴리 – L – ornithine와 코팅 수 4 ° C.에서 하룻밤 incubated) 와시 요리 후 PBS에 대한 DMEM/F12 10 μg / ML laminin 200 μl와 코트 요리와 함께 여러 번 ≥ 37에서 2 시간 ° C. 37 요리에게 PBS로 여러 번 씻어 ° C와 explants은 도금을 위해 준비되기 전까지는 PBS에 둡니다. 국경 assays 들어, 폴리 – ornithine과 코트 요리 위와 같이 다음, 형광 마커와 함께 관심의 단백질과 요리의 코트의 절반은 2 시간에 대한 경계 (예 : BSA, 1:800으로 복합 알렉사 플루어 555 등) 시각화하는 37 ° C. 위에서 설명한 laminin를 추가 후, PBS로 씻으십시오. 부품 2A : utero 망막 electroporation은 생체내에 E14.5 murine retinae으로 DNA를 주입하고 electroporating에서 E13.5 – E14.5 단계 댐에 마취 믹스 intraperitoneal (IP)의 0.15 ML을 주사. 어머니가 마취의 수술 비행기에 도달했습니다 때까지 3~7분을해야합니다. 완전 anesthetized 마우스 hindpaw의 곤란에 응답해서는 안됩니다. 이 기간 동안 parafilm 및 pipet의 작은 조각 잘라 ~ parafilm에 DNA 용액 5 UL합니다. 90 ° 각도에서 플런저 (금속 와이어를) 벤드하고 뽑아 micropippette에를 삽입합니다. 플런저를 사용하여 micropipette (해부 현미경을 사용하여이 프로세스를 지원 가능)로 DNA 솔루션을 대기음. 어머니가 마취의 수술 비행기에 도달하면, 다음 손난로 그녀 등의 측면을 장소, 어머니의 복부에 ~ 2 인치 영역을 면도하는 전기 면도기를 사용합니다. 준비는 알코올 패드로 닦아하여 면도 영역은 요오드 패드 두 번 최소로 따라갔다. 어머니가 전신 마취하에있는 동안 눈을 각막 ulceration을 방지하기 위해 눈은 안과 베트 연고의 드롭 놓습니다. 포셉으로 피부를 파악하고 복막을 노출, 복부의 피부와 근육을 통해 정중선 (~ 1 인치 길이)을 따라 수직으로 절개를 만들기 위해 가위를 사용합니다. 포셉로 복막을 들어 복강 (그림 1) 노출이 세포막을 통해 이와 유사한 수직으로 절개합니다. 다음에 연락하고 머리에 의해 오염되지 않도록 복부 내용을 방지하기 위해 거즈 패드로 수술 부위를 내리면 t동물. 포셉과 함께 피부와 복막 뒤로 당겨와 (가장 접근 배아를 선택) 절개를 통해 배아를 추출하기 위해 해부 주걱을 사용합니다. 이 배아 사이 주걱을 넣고 부드럽게 복강 밖으로 배아 체인을 가져옵니다. 당신은 손가락으로 배아 사슬을 끄집어 수 있습니다. *이 시점부터, 멸균 PBS와 배아는 수산화 유지 * 가열 패드에있는 어머니를 유지, 해부 현미경, 마사지 망막가 직면되도록 배아에 따라 그녀를 놓으십시오. 나는 그것이 더 쉽게 배아가 electroporated되었던 추적할 수 있도록, 중 가장 중간이나 측면 배아로 시작하는 것이 좋습니다. 당신의 지배적인 손에 micropipette를 타고 다른 손으로 배아를 안정화. micropipette으로 피어스 이번에는 질 벽에 및 amniotic 색을 통해 망막. micropipette의 선명도에 따라, 그것이 이번에는 질 벽에에 침투 압력 공정한 금액이 걸릴 수 있지만, 일단 통해 micropipette는 배아와 이상 망막을 입력합니다. 그것이 배아를 입력으로 micropipette의 깊이를 제어하고 측정하기 어려울 수 있습니다. 는 양수와 태아의 사망의 누설 그 결과, 입학 구멍을 확대 방지하기 위해 멤브레인을 관통되면 micropipette 운동의 양을 최소화합니다. 이것은 출혈과 배아 죽음을 초래하므로, 이번에는 질 벽에 천공 혈관을 피하십시오. 일단 micropipette이 망막을 맺고 있다고 확신하는 경우, 당신은 망막에 DNA 솔루션을 추방하기 위해 준비가되어 있습니다. 천천히 플런저를 우울하게하고 동시에 micropipette 종종 망막에 깊이 침투으로 DNA가, micropipette의 경로를 통해 주입 확보, micropipette를 철회. 당신이 망막에있는 경우, 바깥쪽 망막 층과 망막 색소 상피 (RPE) 사이의 extraretinal 공간으로 0.5 μl를 (micropipette에 1 μl 체크 표시 의해 측정할 수) 추방. 당신은 양수 (그림 1)으로 망막 및 누수를 작성 녹색 염료를 관찰해야합니다. electroporation의 충격기는 수술 중에 PBS – 채워진 페트리 접시에 보관해야합니다. 부드럽게 주입 눈과 같은 측면에서 긍정 (+) 외륜과 배아 머리의 측면에 충격기를 놓으십시오. 이 배아의 죽음에 amniotic 색과 결과를 나타납니다로 머리를 고정 압력의 적당한 금액을 적용하지만, 너무 심하게 누르하지 않습니다. 전극이 장소에서하는 경우, 60 Hz의 주파수에서 5 40 V, 50 MS 사각형 펄스를 제공합니다. 어머니가 현재의 피부와 근육으로 탈출에 의한 트위치하는 것은 드문 일이 아니다. 반복 주입하고 electroporated하는 각각의 배아에 대해 7-9 단계를 반복합니다. 난 보통 4-8 DNA의 양에 따라 어머니 당 배아, 태아의 수, 어머니의 상태 및 마취하에 시간을 electroporate. 또는 여러 개의 배아가 주입 수 있으며 다음 electroporated로 주입하여 따로 배아를 electroporating 반대. 배아를 electroporating 후, 복강으로 다시 배아 체인을 대체할 포셉 및 주걱을 사용합니다. 복강에 항생제 – antimycotic 솔루션 ~ 2 ML 하거라. 절개의 앞쪽에 부분에 더블 매듭 시작, 복막을 봉합과 절개의 후부 부분에 간단한 연속 봉합 패턴을 진행하는 hemostat와 집게를 사용하십시오. 봉합사와 봉합 트림 초과를 묶을 수있는 마지막 루프를 사용합니다. 절개가 폐쇄 스테이플하려면, 복막에서 피부를 분리주의하고, 무딘 포셉과 절개의 앞쪽에 부분에서 피부를 리프트. 피부 주변의 스테이플러의 치아를 장소와 스테이플러를 놓으면 되죠. 절개는 보통 5-7 스테이플을 필요로 뒷부분 끝에 폐쇄 stapling 계속합니다. 알코올 패드와 스테이플 주변의 상처를 닦아주십시오. 어머니가 가열 패드 (일반적으로 그녀가 각성하는 15~90분 사이 소요)에 복구하고 그녀가 엎드려서 시작하면, 최대 새로운 케이지 복부 측면에 그녀를 배치하자. 불편이 지속되면 통증과 불편을 최소화하기 위해, 어머니는 나중에 포인트를 각성시 buprenorphine을 (0.05-0.1 MG / kg, SC)를받을합니다. 탈수 방지하기 위해, 1.0 ML은 생리 subcutaneously (SC) 저녁과 다음날이 필요한 경우 ~ 2~4시간 수술 후, 다시하는 경우와 어머니를 주입. 24시간 수술은 어머니가 정상적인 동작을 회복해야하고, 술마시고, 정기적으로 식사를합니다. 부품 2B : electroporated 망막의 망막 utero electroporation 정보 검색에서 E18.5에서 배아 회 ~ 5 ML 만들기, PBS에 4 % paraformaldehyde (PFA)를 준비합니다. Perfusions는 중력 기반 주입 시스템 또는 주사기 펌프와 함께 할 수 있습니다. (또는 E18.5 머리가 단순히 하룻밤 4퍼센트 PFA에 열중하실 수 있습니다.) 와 어머니를 주사마취의 0.2 ML은 IP를 섞어 그녀가 마취하에 완전히 있는지 확인합니다. 복강과 자궁 뿔이 노출 스테이플 아래 피부와 복막를 잘라 가위를 사용합니다. electroporated 배아를 제거하고 복부 측면을 핀. 가슴을 노출하는 ribcage의 복부 피부, 복막, 횡격막과 측면 부분으로 잘라. 피어스 왼쪽 재관류 설정에 붙어있는 나비 바늘로 뇌실 및 microscissors과 오른쪽 아트리움를 잘라. 재관류를 시작하고 PFA는 ~ 60 초 동안 흐름 수, 혈액이 오른쪽 아트리움을 종료해야하며 재관류에 성공하면 배아 창백 될 것입니다. 배아를 참살하고 15 ML 원뿔 병에 4% PFA의 머리를 수집합니다. 모든 electroporated 배아에 대해이 절차를 반복합니다. 며칠 동안 PBS로 세척 후 4 박 4퍼센트 PFA ° C에서 머리를 계속합니다. 모든 배아가 수집됩니다 자궁 전위를 통해 어머니를 안락사. 망막 제거 PBS의 세척 후, 최대 직면하고있는 망막과 해부 접시에 머리를 핀과 PBS에 담가. RPE을 나타내기 위해 망막 주위의 피부를 제거합니다. 26G1 / 2 바늘을 사용하여 주사 렌즈 – RPE의 교차점에서 복부 망막. 이 구멍에 microscissors 중 하나 가장자리를 삽입하고 광학 디스크에 복부 망막을 통해 수직으로 절개합니다. 당신이 그것을 제거할 때이 방향에 망막 당신을 수 있습니다. 세부 점 포셉와 RPE를 제거합니다. 한 포셉와 복부 절개에 RPE를 잡고 특히 RPE가 단단히 연결되어있는 RPE – 렌즈 교차점에서 떨어진 망막의 RPE 껍질 다른 집게를 사용합니다. RPE을 제거한 후, 고급 집게로 렌즈를 파악하고 렌즈를 제거까지 멀리 당기십시오. 시신경의 머리 주위로 집게를 배치하여 망막을 제거하고 망막을 꼬집어. 로 망막을 전송 PBS – 채워진 잘 retinae 와서 추적하는 유지하는 머리에서. contralateral 망막에 대해 4-5 단계를 반복하고, 다른 모든 electroporated 배아하십시오. 비 주입 망막은 immunostaining를 제어하는​​ 역할을합니다. GFP + 세포 (녹색 retinae) 모든 retinae를 검색하기 위해 형광 현미경 해부를 사용하십시오. 모든 GFP + retinae 들어, electroporation이 배아에서 성공하고, 이러한 retinae 및 해당 두뇌는 (시각 시스템을 손상) 자세한 분석 (즉, sectioning 및 immunostaining) (그림 1)에 대해 처리할 수 있습니다. 부품 3A : 전의 생체내 망막 electroporation은 주입과 체외에서 E14.5 murine retinae로 DNA를 electroporating 마취 믹스의 0.2 ML과 E13.5 – E14.5 무대 어머니를 마취하고 그녀가 마취하에 완전히 있는지 확인합니다. 피부와 배아를 노출 복강 잘리는 가위를 사용합니다. 포셉와 배아 체인을 올려 완전히 어머니로부터 배아 전체 체인을 제거하는 결합 조직을 통해 했네요. 얼음 DMEM/F12있는 페트리 접시에 배아 사슬을 놓으십시오. 자궁 경부 전위를 통해 어머니를 안락사. microscissors으로 전체 자궁 벽을 뚫고 들어왔어. 다음 태반에서 amniotic 색과 핀치의 각 배아를 제거하는 집게를 사용합니다. 각각의 배아를 참살하고 얼음에 DMEM/F12 다른 배양 접시에있는 헤드를 수집합니다. 입 pipet 또는 플런저 pipet을 사용하면, (1 부 참조) DNA 솔루션의 원하는 양의 micropipette를 입력합니다. 이 프로토콜에서는 DNA는 말초 등의 망막에 주입됩니다. 하나는 DNA 주입 사이트 및 전극 충격기의 위치를​​ 조정하여 다른 망막 지역을 타겟팅할 수 있습니다. PBS로 해부 접시 한 ​​고개를 전송하고 머리 등의 측면을 핀. 망막 이상의 피부를 제거하는 집게를 사용하십시오. micropipette 개최 ~ 10 ° 수평 위치 (지느러미 망막의 굴절률이 본질적으로 병렬)에서, 그래서 팁이 RPE 및 외부 망막 층 사이에있는 RPE를 통해 micropipette 밀어. 이 공간에 ~ 0.1-0.4 μl DNA 솔루션을 추방, 녹색 액체가 전체 공간을 작성하고 RPE의 구멍을 통해 밖으로 유출 관찰할 수 있어야합니다. contralateral 망막에 대한 주사를 반복합니다. 조심스럽게하지만 빠르게 머리 복부 측면에 긍정 (+) 외륜과 함께 핀을 제거하고 머리 주위 (유지 머리를 PBS에 포장되어) 장소 전극 충격기. 4 40 V, 60 Hz에서 50 MS 펄스 다음, 얼음 (그림 2)에 DMEM/F12와 함께 접시에 다시 머리를 장소 제공합니다. 모든 머리에 대한 모든 DNA 솔루션 5-7 단계를 반복합니다. (주입 각기 다른 DNA 솔루션을 잘 하나) 완료 electroporations 후 4 잘 요리에 산소 SFM 솔루션 ~ 1.5 ML를 추가하고 얼음 계속. 한 망막가 직면와 DMEM/F12과 해부 접시 한 ​​고개를 전송합니다. 복부 망막 (또는 측면 맞은 대상 지역), 공략하기 좋은 포셉를 사용하여그리고 RPE에 구멍을 뚫는. 특히 렌즈 – 망막의 교차점에서 떨어진 망막의 RPE 껍질이 구멍을 통해 포셉의 한쪽 끝을 넣습니다. 이 부화하는 동안 자체로 붕괴하는 망막의 원인이되므로 망막를 잘라내거나 손상하지 마십시오. RPE을 제거한 후, (렌즈 유지) 망막의 기지에 곤란 시신경에 의해 망막을 팝업하는 집게를 사용합니다. 산소 SFM에 retinae을 전송. 머리를 뒤집어 contralateral 눈 반복합니다. 모든 electroporated 머리를위한 9 단계를 완료하십시오. 40-48시간에 대해 37 ° C에서 산소 SFM에서 망막을 품어. 부품 3B : 예 생체내 망막 electroporation의 착취와 GFP의 도금 + 망막 explants (이일 이후 electroporation) DMEM/F12와 페트리 접시의 뚜껑에 산소 SFM 잘 하나에서 모든 retinae을 전송합니다. 한 망막을 선택하고 망막의 GFP + (녹색) 부분을 시각화하는 형광 해부 범위를 사용합니다. microscalpel와 집게를 사용하여 절개하다 단 GFP + 청크 망막의가 ​​남아 있도록 망막의 비 GFP + 부분을 삭제. 지속적으로 특별히 GFP + 망막을 선택 절개를 통해 형광등과 일반 조명 사이를 전환하는 것이 도움이 그것입니다. DMEM/F12와 함께 잘 수있는 GFP + 망막을 전송합니다. 물론 처음부터 모든 망막에 대해 2 단계를 반복합니다. 각각의 DNA 조건 (각 다른 잘) 들어, 새로운 배양 접시와 DMEM/F12 매체를 사용합니다. 이 GFP + retinae 지금은 도금을위한 작은 망막 explants로 해부를해야합니다. 해부 현미경, microscalpel와 작은 explants에 GFP + 망막의 큰 조각을 잘라 버릴거야. Explants는 사각형이어야 길이와 폭 ~ 200-300 μm의. DMEM/F12와 잘 모든 explants를 수집합니다. 한 GFP + 청크 망막 중 ~ 40-10 GFP + 조직의 크기에 따라 망막 explants을 생산해야합니다. 모든 GFP + 수확했다 망막 지역에 대해이 단계를 반복합니다. 모든 GFP + 망막 explants를 준비 후, SFM 250 μl를 추가 + 0.4 %의 메틸 셀룰로오스를 laminin – 코팅 문화 요리 (1 부 참조). (4 ° C에 보관) 전송 4-8 GFP + 문화 요리하고 부드럽게 중간 중심과 접시의 가장자리 사이에 explants와 다각형로 explants를 정렬 포셉를 사용 explants. RGC 레이어입니다 explant 어느 쪽이 더 확인합니다. 가끔 RPE 결정은 반대편이 RGC 레이어는 것을 나타내는 바깥쪽 망막 층에 붙어 남아 있습니다. 또한, RGC 측면은 일반적으로 적절한 explant 방향에 도움이되는 몇 가지 세포 파편있다. 아래 RGC 레이어로, 그것이 유리 coverslip을 준수 수 있도록 단단히 explant의 중심을 우울하게하는 집게를 사용합니다. 포셉에서 explant의 들여쓰기가 표시 수 있으며, 이것은 정상입니다. 문화 접시에있는 모든 explants을 도금 후 37로 전송 ° C 배양기를. 망막 axons 먼저 도금 후 4~6시간을 관찰하고 explants 몇 일 동안 건강하게 남아 있지만, 중요한 전면에 자라난 24 시간 이후에 발생할 수 있습니다. Explants 30 분 immunostained (그림 2) 4% PFA로 고정, 체외의 assays에서 수많은 사용할 수 있습니다. 보더 분석 또는, (1 부 참조) 국경 분석 준비되었습니다 접시 4 GFP + explants를 전송. 경계의 위치를​​ approximating, 접시의 중앙에 수직선에 explants 정렬. 형광 해부 현미경, 접시 아래 explants들이 형광 국경에서 ~ 50-150mm 수 있도록. 국경 기판에 도달하는 RGC axons을위한 충분한 시간을 허용, 24 시간 동안 37 ° C에서 요리를 품다. Explants는 immunostaining (그림 2) 다음, 30 분 4퍼센트 PFA에서 수정하실 수 있습니다. 대표 결과