En électroporation in vivo et ex utero pour l'expression génique dans les cellules ganglionnaires de la rétine de la souris

Partie 1: Mise en place d'in utero et ex vivo électroporations rétiniennes 1. Pour fois in utero et ex vivo électroporations rétiniennes Utilisez un extracteur d'électrode pour préparer à pointe fine micropipettes et de briser la pointe (ou biseau de la pointe) pour faire un point coudée. Préparer des solutions d'ADN pour les concentrations souhaitées et ajoutez une petite quantité de colorant vert rapide (0,05%) pour visualiser les injections. Je recommande 5 solution d'ADN ul par la mère dans l'utérus de la rétine et électroporations une solution d'ADN ul par tête embryonnaires pour électroporations ex vivo de la rétine. Inclure une construction expression de la GFP (protéine fluorescente ou autres) pour visualiser les neurones transfectées. Stériliser les instruments chirurgicaux par autoclave. Préparer le mélange kétamine-xylazine anesthésique avec le rapport suivant (~ 0,2 ml faisant pour chaque femme enceinte): un rapport volumétrique 1.0:0.2:4.6 de 100 pg / ml de kétamine: 100 pg / ml de xylazine: saline. D'autres anesthésiques peuvent être utilisés. 2. Pour en électroporations utero rétine ne Mettez le coussin chauffant et le couvrir avec un pad fessier. Préparer la solution antibiotique-antimycosique (1:100) dans un tampon phosphate salin (PBS) et au chaud sur un coussin chauffant. Préparer ~ 2 ml pour chaque barrage. Placez une filtration stérile de PBS dans le bain d'eau tiède. 3. Pour électroporations ex vivo la rétine ne Préparer oxygénée milieu sans sérum (SFM) pour l'incubation rétine: Bubble 25 ml de DMEM/F12 avec 95% d'oxygène / dioxyde de carbone de 5% pour ≥ 2 heures. Pour le support de 25 ml oxygénée, ajoutez 0,25 g d'albumine sérique bovine (BSA), 250 pi de son supplément et 50 pi de pénicilline-streptomycine solution. Mélanger la solution pour dissoudre la BSA, puis filtre stérile la solution. Cette solution devrait être préparée pour chaque expérience électroporation. Préparer milieu SFM méthylcellulose + 0,4% pour l'incubation des explants rétiniens: autoclave 0,20 g de méthylcellulose dans un flacon de 150 ml avec un aimant mélanger. Préparer 50 ml de GDF (comme ci-dessus, sans bulles) et ajouter à la bouteille méthylcellulose autoclave. Mélanger cette solution à 4 ° C pendant la nuit. Filtre stérile cette solution le lendemain et conserver à 4 ° C, cette solution peut être conservé pendant ~ 1 mois. Le jour de la récolte explant rétine (partie 5), préparer des plats pour le placage explant rétine: Manteau plats en verre à fond la culture avec 250 pi de poly-L-ornithine pour ≥ 2 heures à 37 ° C. (Sinon, les plats peuvent être recouvertes de poly-L-ornithine la journée précédente et incubés une nuit à 4 ° C) Lavez la vaisselle à plusieurs reprises avec du PBS, puis mets manteau avec 200 ul de 10 ug / ml de laminine dans DMEM/F12 pour ≥ 2 heures à 37 ° C. Lavez la vaisselle à plusieurs reprises avec du PBS à 37 ° C et laisser sur PBS jusqu'à explants sont prêts pour le placage. Pour les dosages des frontières, des plats manteau avec le poly-ornithine comme ci-dessus, puis la moitié manteau de la capsule avec la protéine d'intérêt avec un marqueur fluorescent pour visualiser la frontière (comme Alexa Fluor 555 conjugué à la BSA, 1:800) pendant 2 heures à 37 ° C. Laver avec du PBS, puis ajouter la laminine comme décrit ci-dessus. Partie 2A: In utero électroporation rétine injectables et électroporation ADN dans la rétine de souris E14.5 in vivo Injecter 0,15 ml de la combinaison d'anesthésie intrapéritonéale (IP) dans un barrage E13.5 E14.5-scène. Il devrait prendre 3-7 minutes jusqu'à ce la mère a atteint un plan chirurgical de l'anesthésie. Une souris totalement anesthésié ne doit pas répondre à un pincement de la patte arrière. Pendant ce temps, couper un petit morceau de parafilm et pipette ~ 5 ul de solution d'ADN sur le parafilm. Pliez un plongeur (fil métallique) à un angle de 90 ° degré et l'insérer dans une micropippette tiré. En utilisant le piston, aspirer la solution d'ADN dans la micropipette (en utilisant un microscope à dissection peut faciliter ce processus). Une fois que la mère a atteint un plan chirurgical de l'anesthésie, l'utilisation d'un rasoir électrique pour raser une région de ~ 2 pouces de l'abdomen de la mère s, puis placer sa face dorsale vers le bas sur le coussin chauffant. Préparation de la zone rasée en essuyant avec une compresse imbibée d'alcool suivi d'un coussin d'iode un minimum de deux fois. Déposer une goutte de pommade ophtalmique Vet sur chaque œil afin de prévenir ulcération de la cornée de l'œil tandis que la mère est sous anesthésie générale. Avec la pince, saisir la peau et utiliser les ciseaux pour faire une incision verticale le long de la ligne médiane (~ 1 pouce de long) à travers la peau et les muscles de l'abdomen, ce qui expose le péritoine. Soulevez le péritoine avec la pince et faire une incision verticale similaire à travers cette membrane pour exposer la cavité abdominale (figure 1). Puis drapent le champ opératoire avec des compresses de gaze pour empêcher le contenu de l'abdomen de contacter et d'être contaminés par les cheveuxde l'animal. Tirez la peau et le péritoine avec la pince et l'utilisation de la spatule pour extraire la dissection d'un embryon à travers l'incision (choisir l'embryon le plus accessible). Placez la spatule entre deux embryons et tirez doucement la chaîne embryonnaire, hors de la cavité abdominale. Vous pouvez retirer de la chaîne embryonnaire, avec vos doigts. * A partir de ce point en avant, garder les embryons hydraté avec du PBS stérile * Gardez la mère sur le coussin chauffant, sa place sous le microscope de dissection et un massage d'un embryon de telle sorte que la rétine est dirigée vers le haut. Je recommande de commencer avec soit de l'embryon le plus médiale ou latérale, ce qui rend plus facile à garder une trace des embryons ont été électroporés. Prenez la micropipette dans votre main dominante et à stabiliser l'embryon avec votre autre main. Avec la micropipette, percer la rétine à travers la paroi utérine et le sac amniotique. Selon la netteté de la micropipette, cela peut prendre une bonne quantité de pression pour pénétrer dans la paroi utérine, mais une fois à travers, la micropipette entrera l'embryon et, idéalement, la rétine. Il peut être difficile à contrôler et évaluer la profondeur de la micropipette à son entrée dans l'embryon. Minimiser la quantité de mouvement micropipette une fois qu'elle a percé la membrane pour éviter l'élargissement du trou d'entrée, entraînant la fuite de liquide amniotique et la mort des embryons. Évitez les vaisseaux sanguins perçage dans la paroi utérine, comme cela va entraîner des saignements et de la mort des embryons. Une fois que vous êtes confiant que la micropipette est entré dans la rétine, vous êtes prêt à expulser la solution d'ADN dans la rétine. Enfoncez lentement le piston et retirer simultanément de la micropipette, veillant à ce que l'ADN est injecté à travers le chemin de la micropipette, comme la micropipette pénètre souvent profonde de la rétine. Si vous êtes dans la rétine, d'expulser 0,5 pl (peut être mesurée par l'une des marques de graduation sur la micropipette ul) dans l'espace extrarétinienne entre la couche externe de la rétine et l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Vous devez respecter colorant vert remplissant la rétine et les fuites hors dans le liquide amniotique (Figure 1). Les palettes électroporation devraient être conservés dans un plat rempli de PBS Pétri pendant la chirurgie. Placez délicatement les palettes sur les côtés de la tête de l'embryon avec le positif (+) à aubes sur le même côté que l'œil injecté. Appliquer une quantité modérée de la pression pour stabiliser la tête, mais ne pas appuyer trop fort, car cela fera éclater le sac amniotique et entraîner la mort des embryons. Lorsque les électrodes sont en place, fournir 5 à 40 V, 50 ms impulsions carrées à une fréquence de 60 Hz. Il n'est pas inhabituel pour la mère à se contracter en raison d'échapper actuelle à la peau et les muscles. Répétez les étapes 7-9 pour chaque embryon doit être injecté et électroporé. J'ai l'habitude de électroporation embryons 4-8 par la mère, selon le montant de l'ADN, le nombre d'embryons, l'état de la mère, et la quantité de temps sous anesthésie. Sinon, plusieurs embryons peuvent être injectés puis électroporées, par opposition à l'injection et électroporation chaque embryon séparément. Après électroporation les embryons, l'utilisation de la pince et une spatule pour remplacer la chaîne embryonnaire dans la cavité abdominale. Verser environ 2 ml de la solution antibiotique-antimycosique dans la cavité abdominale. Utilisez la pince hémostatique et les forceps pour suturer le péritoine, à commencer par un double noeud sur la partie antérieure de l'incision et de procéder à un modèle de suture continue simple à la partie postérieure de l'incision. Utilisez la dernière boucle pour attacher le fil de suture et des garnitures de suture excès. Pour agrafer l'incision fermée, soulever la peau à la partie antérieure de l'incision avec une pince émoussée, en prenant soin de séparer la peau du péritoine. Placer les dents de l'agrafeuse autour de la peau et à déprimer l'agrafeuse. Poursuivre l'incision agrafage fermé à l'extrémité postérieure, qui nécessite habituellement agrafes 5-7. Essuyez la plaie autour du agrafes avec un tampon imbibé d'alcool. Laissez la mère de récupérer sur le coussin chauffant (prend généralement entre 15-90 minutes pour qu'elle puisse s'éveiller) et quand elle commence à rouler, sa place dans un côté de la cage abdominale jusqu'à nouvelle. Afin de minimiser la douleur et l'inconfort, les mères reçoivent la buprénorphine (0,05-0,1 mg / kg, sc) au réveil, et au plus tard, le temps des points si l'inconfort persiste. Pour prévenir la déshydratation, injecter de la mère avec 1,0 ml de sérum physiologique par voie sous cutanée (sc) ~ 2-4 heures après la chirurgie, et encore si le soir et le lendemain si nécessaire. 24 heures après la chirurgie, la mère devrait retrouver un comportement normal et boire et de manger régulièrement. Partie 2B: En Retrieval utero électroporation rétiniennes de la rétine électroporation à E18.5 Préparer 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans le PBS, rendant ~ 5 ml par embryon. Perfusions peut être fait avec un système de perfusion par gravité base ou d'une seringue. (Sinon, E18.5 tête peut simplement être immergé dans PFA 4% pendant la nuit.) Injecter la mère avec0,2 ml d'anesthésique mélangez IP et s'assurer qu'elle est entièrement sous anesthésie. Utilisez des ciseaux pour couper la peau et le péritoine au-dessous des agrafes pour exposer la cavité abdominale et les cornes utérines. Retirer un embryon électroporées et la broche qu'il place face ventrale. Couper à travers les portions de peau, le péritoine, le diaphragme et abdominale latérale de la cage thoracique afin d'exposer le cœur. Percer le ventricule gauche avec l'aiguille à ailettes attachées à la configuration de perfusion, et couper l'oreillette droite avec un microciseaux. Démarrer la perfusion et de permettre aux PFA débit pour ~ 60 secondes, le sang devrait quitter l'oreillette droite et l'embryon devrait devenir pâle si la perfusion est réussie. Décapiter l'embryon et de recueillir la tête dans 4% des PFA dans 15 ml flacon conique. Répétez cette procédure pour tous les embryons électroporé. Gardez la tête dans 4% PFA nuit à 4 ° C, puis lavez dans du PBS pendant plusieurs jours. Euthanasier mère via dislocation cervicale quand tous les embryons sont recueillis. Retrait de la rétine Après des lavages PBS, la broche de la tête dans un plat à dissection avec la rétine vers le haut et plonger dans du PBS. Enlevez la peau de la rétine autour de révéler l'EPR. En utilisant une aiguille 26G1 / 2, à la perforation de la rétine ventrale à la jonction de lentilles EPR. Insérer un bord d'une microciseaux dans ce trou et faire une incision verticale à travers la rétine ventrale du disque optique. Cela vous permettra d'orienter la rétine lorsque vous le retirez. Retirez l'EPR avec de beaux points de forceps. Prenez l'EPR à l'incision ventrale avec une pince et l'utilisation de pinces d'autres à peler l'EPR loin de la rétine, plus précisément à la jonction RPE-lentille où l'EPR est fermement attaché. Après avoir retiré l'EPR, saisir la lentille avec une pince fine et tirez vers le haut et loin pour retirer la lentille. Retirez la rétine en plaçant une pince autour de la tête du nerf optique et pincez rétine. Transfert rétine à une PBS-bien remplie, garder une trace de ce qui est venu la rétine à partir de laquelle les têtes. Répétez les étapes 4-5 pour la rétine contralatérale, et pour tous les autres embryons électroporé. La rétine non injectée sert de contrôle pour l'immunocoloration. Utiliser un microscope à fluorescence pour analyser tous les disséquer pour les retinae cellules GFP + (vert rétine). Pour tous les GFP + rétine, l'électroporation a réussi à cet embryon, et ces cerveaux rétine et correspondant (avec le système visuel intact) peuvent être traitées pour une analyse plus poussée (c'est à dire de sectionnement et immunocoloration) (figure 1). Partie 3a: électroporation ex vivo la rétine par injection et électroporation ADN dans la rétine de souris E14.5 in vitro Anesthetize une mère E13.5 E14.5-scène avec 0,2 ml du mélange anesthésique et de s'assurer qu'elle est entièrement sous anesthésie. Utilisez des ciseaux pour couper à travers la peau et la cavité abdominale pour exposer les embryons. Soulevez la chaîne embryonnaire, avec une pince et couper à travers le tissu conjonctif de supprimer complètement l'ensemble de la chaîne embryonnaire, de la mère. Placez la chaîne embryonnaire dans une boîte de Pétri avec DMEM/F12 sur la glace. Euthanasier mère via dislocation cervicale. Couper à travers la paroi utérine avec un ensemble microciseaux. Ensuite, utilisez une pince pour retirer chaque embryon du sac amniotique et le placenta pincer. Décapitez chaque embryon et de recueillir les têtes dans une autre boîte de Pétri avec DMEM/F12 sur la glace. En utilisant une pipette ou une pipette bouche piston, remplissez micropipette avec la quantité désirée de solution d'ADN (voir partie 1). Dans ce protocole, l'ADN sera injecté dans la rétine périphérique dorsale. On peut cibler d'autres régions rétiniennes en ajustant le site d'injection de l'ADN et le positionnement des palettes électrode. Transfert d'une tête à plat disséquer avec du PBS et broches côté de la tête jusqu'à dorsale. Utilisez une pince pour enlever la peau au-dessus de la rétine. En tenant la micropipette ~ 10 ° de la position horizontale (essentiellement parallèle à la courbure de la rétine dorsale), poussez micropipette travers l'EPR afin que la pointe se situe entre l'EPR et la couche extérieure de la rétine. Expulser ~ de 0,1 à 0,4 ul solution d'ADN dans cet espace; liquide vert devrait être observable remplissage de l'espace entier et s'échappe par le trou dans le RPP. Répéter l'injection de la rétine contralatérale. Soigneusement, mais rapidement enlever les broches et (tête gardant immergé dans du PBS) palettes d'électrodes lieu autour de la tête, avec le positif (+) à aubes sur la face ventrale de la tête. Livrer 4 40-V, 50 impulsions ms à 60 Hz, puis placer la tête en arrière dans un plat avec les DMEM/F12 sur glace (figure 2). Répétez les étapes 5-7 pour tous les chefs et pour toutes les solutions d'ADN. Après l'achèvement électroporations, ajouter ~ 1,5 ml de solution de GDF oxygénée dans un plat 4-même et de garder sur la glace (un puits pour chaque solution d'ADN différentes injecté). Transfert d'une tête dans un plat à disséquer à DMEM/F12, avec une rétine vers le haut. Sur la rétine ventrale (ou région cible côté opposé), utilisez une pince fine à pinceret déchirer un trou dans le RPP. Insérez une extrémité de la pince à travers ce trou pour éplucher l'EPR loin de la rétine, plus précisément à la jonction cristallin-rétine. Ne pas couper ou endommager la rétine parce que cela va provoquer la rétine à l'effondrement sur elle-même pendant l'incubation. Après avoir retiré l'EPR, l'utilisation des forceps pour sortir rétine par pincement du nerf optique à la base de la rétine (laisser intacte la lentille). Transfert à l'AFD retinae oxygénée. Retourner la tête et répéter pour oeil controlatéral. Remplissez l'étape 9 pour tous les chefs électroporé. Incuber rétine dans GDF oxygénée à 37 ° C pendant 40-48 heures. Partie 3b: Ex vivo récolte électroporation rétine et le placage de la GFP + explants rétiniens (2 jours après l'électroporation) Transférer toutes rétine d'un puits de la GDF oxygéné dans une boîte de Pétri avec couvercle DMEM/F12. Sélectionnez une rétine et l'utilisation fluorescentes champ dissection de visualiser la GFP + (vert) portion de la rétine. L'utilisation d'un microscalpel et forceps, dissèquent et jetez la partie non-GFP + de la rétine afin que seule une GFP + morceau de la rétine reste. Il est utile de constamment alterner entre la lumière fluorescente et réguliers tout au long de la dissection d'sélectionner spécifiquement les cellules GFP + rétine. Transférer la GFP + rétine à un puits avec DMEM/F12. Répétez l'étape 2 pour toutes la rétine d'un puits. Pour chaque condition de l'ADN (chaque puits différents), l'utilisation d'un nouveau plat de Petri et DMEM/F12. Ces cellules GFP + rétine doit maintenant être disséqué en petits explants rétiniens pour le placage. Sous un microscope à dissection, coupe grand morceau de GFP + rétine en petits explants avec une microscalpel. Explants doivent être rectangulaires, ~ 200-300 um de longueur et de largeur. Collecter toutes les explants dans un puits avec DMEM/F12. Une GFP + morceau de la rétine devrait produire 40 à 10 ~ GFP + explants rétiniens selon la taille des tissus. Répétez cette étape pour tous les GFP + régions rétiniennes qui ont été récoltés. Après la préparation de toutes les cellules GFP + explants rétiniens, ajouter 250 l de GDF + méthylcellulose 0,4% (conservé à 4 ° C) pour des boîtes de culture laminine-couché (voir partie 1). 4-8 Transfert GFP + explants à l'antenne de la culture et l'utilisation de la pince doucement arranger les explants dans un polygone, avec des explants situé à mi chemin entre le centre et le bord du plat. Déterminez de quel côté de l'explant est la couche du CJR. Parfois cristaux RPE restent attachés à la couche externe de la rétine, ce qui indique que le côté opposé est la couche du CJR. De plus, le côté CJR a généralement des débris cellulaires qui peuvent aider dans l'orientation correcte explant. Avec la couche CJR bas, utilisez une pince fermement enfoncer le centre de l'explant de sorte qu'il se conformera à la lamelle de verre. Une entaille dans l'expiant de la pince peut être visible, ce qui est normal. Après étalement tous les explants sur un plat de la culture, le transfert à un 37 ° C incubateur. Axones rétiniens sont d'abord observés 4-6 heures après le placage et les explants restent sains pour plusieurs jours, mais une prolifération importante peut survenir après 24 heures. Explants peuvent être utilisées pour de nombreux tests in vitro, fixée à 4% PFA pendant 30 minutes et immunocolorés (figure 2). Assay frontaliers Sinon, le transfert de 4 GFP + explants à un plat qui a été préparé pour le dosage de la frontière (voir partie 1). Disposez les explants dans une ligne verticale au centre du plat, se rapprochant de l'emplacement de la frontière. Sous un microscope à fluorescence, disséquant la plaque des explants de sorte qu'ils soient ~ 50-150 mm de la frontière fluorescentes. Incuber les plats à 37 ° C pendant 24 heures, permettant amplement de temps pour atteindre les axones CJR substrat frontière. Explants peut être fixé à 4% PFA pendant 30 minutes, suivie par immunomarquage (figure 2). Les résultats représentatifs