In utero und ex vivo Elektroporation für die Genexpression in Maus retinalen Ganglienzellen

Teil 1: Einrichten der in utero und ex vivo Retina electroporations 1. Für beide in utero und ex vivo Retina electroporations Verwenden Sie eine Elektrode puller zu spitzen Mikropipetten vorzubereiten und brechen die Spitze (oder Abschrägung der Spitze), um eine abgewinkelte Punkt zu machen. Bereiten DNA-Lösungen auf die gewünschte Konzentration und eine kleine Menge von Fast Green Dye (0,05%) auf Injektionen zu visualisieren. Ich empfehle 5 pl DNA-Lösung pro Mutter in utero Netzhaut electroporations und 1 ul DNA-Lösung pro embryonalen Kopf für ex vivo Retina electroporations. Fügen Sie eine GFP-Expression zu konstruieren (oder andere fluoreszierende Protein) auf transfizierten Neuronen zu visualisieren. Sterilisieren Instrumente via Autoklaven. Bereiten Sie die Ketamin-Xylazin Narkose vermischen sich mit dem folgenden Verhältnis (was ~ 0,2 ml für jede schwangere Frau): a 1.0:0.2:4.6 Volumenverhältnis von 100 pg / ml Ketamin: 100 ug / ml Xylazin: Kochsalzlösung. Andere Anästhetika verwendet werden. 2. Denn in utero Netzhaut electroporations nur Schalten Sie den Heizkissen und decken Sie es mit einer Windel pad. Bereiten Sie die Antibiotika-Antimykotika-Lösung (1:100) in Phosphatpuffer (PBS) und warm auf Heizkissen. Bereiten Sie ~ 2 ml für jeden Damm. Legen Sie sterilfiltriert PBS in warmen Wasserbad. 3. Für ex vivo Retina electroporations nur Bereiten Sauerstoff serumfreiem Medium (SFM) für Netzhaut Inkubation: Bubble 25 ml DMEM/F12 mit 95% Sauerstoff / 5% Kohlendioxid für ≥ 2 Stunden. Um die 25 ml Sauerstoff Medium, fügen 0,25 g Rinderserumalbumin (BSA), 250 ul ITS ergänzen und 50 ul Penicillin-Streptomycin-Lösung. Mischen Sie die Lösung des BSA auflösen, dann steril filtrieren. Diese Lösung sollte frisch zubereitet für jeden Elektroporation Experiment sein. Bereiten Sie SFM + 0,4% Methylcellulose-Medium für Netzhaut-Explantat Inkubation: Autoclave 0,20 g Methylcellulose in einem 150 ml-Flasche mit einem Aufsehen Magnet. Bereiten Sie 50 ml SFM (wie oben, ohne Blasenbildung), und fügen autoklaviert Methylcellulose Flasche. Mix dieser Lösung bei 4 ° C über Nacht. Sterilfilter diese Lösung am nächsten Tag und lagern bei 4 ° C, kann diese Lösung für ~ 1 Monat aufbewahrt werden. Am Tag der Netzhaut Explantation Ernte (Teil 5), bereiten die Gerichte für Netzhaut-Explantat-Beschichtung: Coat Glasboden Kulturschalen mit 250 ul von Poly-L-Ornithin für ≥ 2 Stunden bei 37 ° C. (Alternativ Gerichte können mit Poly-L-Ornithin beschichtet werden am Vortag und über Nacht bei 4 ° C) waschen Geschirr mehrmals mit PBS, dann Mantel Gerichte mit 200 ul von 10 pg / ml Laminin in DMEM/F12 für ≥ 2 Stunden bei 37 ° C. Geschirr spülen mehrmals mit PBS bei 37 ° C und verlassen auf PBS, bis Explantate bereit für die Beschichtung sind. Für Grenze Assays, Mantel Gerichte mit Poly-Ornithin wie oben, dann Mantel die Hälfte der Schale mit Protein von Interesse mit einem fluoreszierenden Marker an der Grenze (wie Alexa 555 konjugierten BSA, 1:800) für 2 Stunden bei visualisieren 37 ° C. Waschen mit PBS, dann fügen Sie Laminin wie oben beschrieben. Teil 2A: In utero Netzhaut Elektroporation Injektion und Elektroporation von DNA in E14.5 murine retinae in vivo Spritzen Sie 0,15 ml des Anästhetikums Mischung intraperitoneal (ip) in eine E13.5-E14.5 Bühne Damm. Es sollte 3-7 Minuten, bis Mutter eines chirurgischen Ebene der Narkose erreicht hat. Ein voll narkotisierten Maus sollte nicht kneifen der Hinterpfote reagieren. Während dieser Zeit, schnitt ein kleines Stück Parafilm und pipet ~ 5 ul der DNA-Lösung auf die Parafilm. Beugen einem Kolben (Metalldraht) in einem 90 °-Grad-Winkel und legen Sie sie in einem gezogenen micropippette. Mit dem Stößel, saugen die DNA-Lösung in die Mikropipette (mit einem Binokular können diesen Prozess zu unterstützen). Nachdem die Mutter eines chirurgischen Ebene der Narkose erreicht hat, verwenden Sie einen elektrischen Rasierer, um a ~ 2-Zoll-Region der Mutter s Bauch rasieren, dann setzen sie dorsalen Seite nach unten auf dem Heizkissen. Prep die rasierte Fläche durch Abwischen mit einem Alkohol-Pad, gefolgt von einer Jod-Pad ein Minimum von zwei mal. Geben Sie einen Tropfen der ophthalmischen Vet Salbe auf jedes Auge zu Hornhautulzeration der Augen zu verhindern, während die Mutter wird unter Vollnarkose. Mit der Zange, greifen die Haut und die Schere, um einen vertikalen Schnitt entlang der Mittellinie (~ 1 cm lang) machen durch die Haut und Muskulatur des Bauches, Freilegung der Bauchfell. Heben Sie das Bauchfell mit der Zange und einen ähnlichen vertikalen Schnitt durch die Membran in die Bauchhöhle (Abbildung 1) aussetzen. Dann hängen Sie die OP-Feld mit Gaze-Pads, die Bauch-Inhalte für den Kontakt und durch die Haare kontaminiert verhinderndes Tieres. Ziehen Sie die Haut und Bauchfell mit der Zange und nutzen Sie die Sezieren Spatel auf ein Embryo durch den Schnitt-Extrakt (wählen Sie den am besten zugänglichen Embryo). Setzen Sie den Spatel zwischen 2 Embryonen und ziehen Sie den embryonalen Kette aus der Bauchhöhle. Sie können ziehen Sie die embryonale Kette mit Ihren Fingern. * Von diesem Punkt an, halten Sie die Embryonen hydratisiert mit sterilem PBS * Halten Sie die Mutter auf dem Heizkissen, statt sie unter dem Binokular und Massage ein Embryo, so dass die Netzhaut nach oben zeigt. Ich empfehle entweder mit der mediale oder laterale Embryos ab, wodurch es leichter zu verfolgen, welche Embryonen wurden elektroporiert halten. Nehmen Sie die Mikropipette in Ihrer dominanten Hand und stabilisieren den Embryo mit der anderen Hand. Mit der Mikropipette, durchbohren die Netzhaut durch die Gebärmutterwand und Fruchtblase. Je nach Schärfe der Mikropipette, kann es eine ganze Menge Druck auf die Gebärmutterwand eindringen zu nehmen, aber einmal durch, wird die Mikropipette geben den Embryo und im Idealfall der Netzhaut. Es kann schwierig sein zu steuern und zu messen die Tiefe der Mikropipette, wie es der Embryo gelangt. Minimieren Sie die Anzahl der Mikropipette Bewegung, sobald es die Membran durchstochen, um zu verhindern Erweiterung der Einfahrt Loch, wodurch das Austreten des Fruchtwassers und Embryo Tod. Vermeiden Sie Piercing Blutgefäße in der Gebärmutterwand, da dies in Blutungen und Embryo zum Tod führen. Sobald Sie zuversichtlich, dass die Mikropipette hat der Netzhaut eingetragen sind, sind Sie bereit, die DNA-Lösung in die Netzhaut zu vertreiben. Drücken Sie langsam den Kolben und gleichzeitig zurückziehen Mikropipette, dass DNA in den Pfad der Mikropipette injiziert wird, da die Mikropipette oft dringt tief auf der Netzhaut. Wenn Sie in der Netzhaut sind, zu vertreiben 0,5 ul (kann durch die 1 ul Markierungen auf der Mikropipette gemessen werden) in die extraretinal Raum zwischen der äußeren Netzhaut und des retinalen Pigmentepithels (RPE). Sie sollten beobachten, grünen Farbstoff Füllung der Retina und entweicht ins Fruchtwasser (Abbildung 1). Die Elektroporation Paddel sollten in einer PBS-gefüllten Petrischale während der Operation gehalten werden. Sanft legen Sie die Paddel auf den Seiten des Embryos Kopf mit dem Pluspol (+) Paddel auf der gleichen Seite wie das injizierte Auge. Tragen Sie eine moderate Menge an Druck auf den Kopf zu stabilisieren, aber nicht zu hart drücken, da dies die Fruchtblase und das Ergebnis in Embryo Tod Pop. Wenn die Elektroden vorhanden sind, liefern 5 40-V, 50 ms Rechteckimpulse mit einer Frequenz von 60 Hz. Es ist nicht ungewöhnlich für die Mutter zu zucken aufgrund der aktuellen Flucht in die Haut und Muskeln. Wiederholen Sie die Schritte 7-9 für jeden Embryo injiziert und elektroporiert werden. Ich in der Regel elektroporieren 4-8 Embryonen pro Mutter, je nach Menge an DNA, die Anzahl der Embryonen, Zustand der Mutter, und die Zeit unter Narkose. Alternativ können mehrere Embryonen injiziert und anschließend elektroporiert, wie der Injektion und Elektroporation von jedem Embryo getrennt gegenüber. Nach Elektroporation der Embryonen, die Pinzette und Spachtel auf die embryonale Kette wieder ersetzen in die Bauchhöhle. Gießen Sie ca. 2 ml des Antibiotikums-Antimykotikum-Lösung in die Bauchhöhle. Verwenden Sie die hemostat Zangen-und Bauchfell Naht, beginnend mit einem doppelten Knoten auf dem vorderen Teil des Schnittes und fahren Sie mit einer einfachen fortlaufenden Naht Muster auf den hinteren Teil des Schnittes. Verwenden Sie die letzte Runde zu binden Sie den Faden und schneiden überschüssige Faden. So heften die Inzision verschlossen, heben Sie die Haut an der vorderen Theil des Schnittes mit einer stumpfen Zange, wobei darauf geachtet, die Haut vor dem Bauchfell zu trennen. Legen Sie die Zähne der Hefter rund um die Haut und drücken Sie den Hefter. Weiter Heften der Einschnitt geschlossen, um das hintere Ende, das erfordert in der Regel 5-7 Heftklammern. Wischen Sie die Wunde um die Heftklammern mit einer Alkohol-Pad. Lassen Sie die Mutter auf dem Heizkissen (dauert in der Regel zwischen 15-90 Minuten für sie zu wecken) erholen, und wenn sie zu rollen beginnt, legen Sie sie in einen neuen Käfig abdominalen Seite nach oben. Zur Minimierung von Schmerzen und Beschwerden, erhalten Mütter Buprenorphin (0,05-0,1 mg / kg, sc) nach dem Aufwachen, und zu späteren Zeitpunkten, wenn Beschwerden nicht nachlassen. Um zu verhindern, Dehydratation, spritzen die Mutter mit 1,0 ml Kochsalzlösung subkutan (sc) ~ 2-4 Stunden nach der Operation, und wieder, wenn am Abend und am folgenden Tag, wenn nötig. 24 Stunden nach der Operation, sollte die Mutter wieder ein normales Verhalten und trinken und zu essen regelmäßig. Teil 2B: In utero Netzhaut Elektroporation Retrieval von elektroporiert Netzhaut E18.5 Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS, was ca. 5 ml pro Embryo. Perfusionen kann mit einem Schwerpunkt-basierte Infusion System oder eine Spritzenpumpe erfolgen. (Alternativ können E18.5 Kopf einfach in 4% PFA über Nacht getaucht werden.) Spritzen Sie die Mutter mit0,2 ml Anästhetikum Mix ip und sicherzustellen, dass sie vollständig unter Narkose. Verwenden Sie eine Schere, um die Haut und Bauchfell unter dem Stapel geschnitten, um die Bauchhöhle und Uterushörner aussetzen. Entfernen eines elektroporiert Embryo und stecken Sie es Bauchseite auf. Schnitt durch die Bauchhaut, Peritoneum, Zwerchfell und seitlichen Abschnitte des Brustkorbs das Herz aussetzen. Pierce die linke Herzkammer mit dem Butterfly-Nadel befestigt, um die Perfusion Setup, und schneiden Sie den rechten Vorhof mit einem Mikroschere. Starten Sie die Durchblutung und damit PFA für ~ 60 Sekunden fließen, Blut sollte den rechten Vorhof zu beenden und den Embryo sollte blaß geworden, wenn die Perfusion erfolgreich ist. Enthaupten des Embryos und sammeln Kopf in 4% PFA in 15-ml konische Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle elektroporiert Embryonen. Halten Sie den Kopf in 4% PFA über Nacht bei 4 ° C, und dann waschen in PBS für mehrere Tage. Euthanize Mutter über Genickbruch, wenn alle Embryonen erhoben werden. Entfernen Netzhaut Nach PBS gewaschen, pin den Kopf in einer Schüssel mit Dissektion der Netzhaut nach oben und tauchen in PBS. Entfernen Sie die Haut vor der ganzen Netzhaut, die RPE offenbaren. Mit einem 26G1 / 2 Nadel Punktion der ventralen Retina am Objektiv-RPE Kreuzung. Legen Sie eine Kante eines Mikroschere in dieses Loch und einen vertikalen Schnitt durch den ventralen Retina zum Sehnerv. Dadurch werden Sie zu orientieren ermöglichen die Netzhaut, wenn Sie es zu entfernen. Entfernen Sie die RPE mit feinen Pinzetten-Punkt. Besorgen Sie sich die RPE am ventralen Schnitt mit einer Pinzette und verwenden andere Zange zu schälen RPE weg von der Netzhaut, die speziell auf die RPE-Objektiv Kreuzung, wo die RPE fest angebracht ist. Nach dem Entfernen der RPE, fassen Sie das Objektiv mit feinen Pinzetten und ziehen auf und davon, um die Linse zu entfernen. Entfernen Netzhaut, indem Zange um Sehnervenkopfes und kneifen Sie Netzhaut. Transfer Netzhaut zu einer PBS-gefüllten gut, die Verfolgung von denen retinae kam aus dem Kopf. Wiederholen Sie die Schritte 4-5 für die kontralaterale Netzhaut und für alle anderen elektroporiert Embryonen. Die nicht-injizierten Netzhaut dient als Kontrolle für die Immunfärbung. Verwenden Sie einen fluoreszierenden Präpariermikroskop alle retinae für GFP +-Zellen (grün retinae) zu scannen. Für alle GFP + retinae wurde die Elektroporation in diesem Embryo erfolgreich, und diese retinae und entsprechende Gehirn (mit dem visuellen System intakt) können für weitere Analysen (zB Schneiden und Immunfärbung) (Abbildung 1) verarbeitet werden. Teil 3a: Ex-vivo-Elektroporation Netzhaut Injektion und Elektroporation von DNA in E14.5 murine retinae in vitro Anesthetize ein E13.5-E14.5 Bühne Mutter mit 0,2 ml des Anästhetikums mischen und sicherstellen, dass sie vollständig unter Narkose. Mit einer Schere durch die Haut und Bauchhöhle, um Embryonen freizulegen. Heben Sie embryonalen Kette mit einer Zange und Schnitt durch das Bindegewebe vollständig zu entfernen gesamten embryonalen Kette von der Mutter. Legen Sie embryonalen Kette in einer Petrischale mit DMEM/F12 auf Eis. Euthanize Mutter über Genickbruch. Schnitt durch die gesamte Wand des Uterus mit einem Mikroschere. Dann nutzen Sie Zange zu jeder Embryo aus der Fruchtblase und Plazenta abklemmen zu entfernen. Enthaupten jedem Embryo und sammeln Köpfe in eine andere Petrischale mit DMEM/F12 auf Eis. Mit Mund Pipette oder Kolben pipettieren, füllen Mikropipette mit der gewünschten Menge an DNA-Lösung (siehe Teil 1). In diesem Protokoll wird DNA in die periphere Netzhaut dorsal injiziert werden. Man kann andere Retina-Regionen durch Anpassung der DNA an der Injektionsstelle und die Positionierung der Elektrode Paddel Ziel. Übertragen einem Kopf zum Sezieren Schale mit PBS und Pin den Kopf dorsal nach oben. Verwenden einer Pinzette die Haut vor Netzhaut zu entfernen. Halten Sie die Mikropipette ~ 10 ° aus der horizontalen Position (im Wesentlichen parallel zur Krümmung der dorsalen Retina), Push-Mikropipette durch die RPE so dass die Spitze zwischen den RPE und äußeren Netzhaut ist. Expel ~ 0,1-0,4 ul DNA-Lösung in diesem Bereich; grüne Flüssigkeit sollte beobachtbare Füllung gesamten Raum und entweicht durch das Loch in RPE werden. Wiederholen Sie die Injektion für die kontralaterale Netzhaut. Vorsichtig, aber schnell zu entfernen, die Stifte und (halten den Kopf in PBS getaucht) Ort Elektrode Paddel um den Kopf, mit dem Pluspol (+) Paddel auf der Bauchseite des Kopfes. Deliver 4 40-V, 50 ms Pulse bei 60 Hz, legen Sie dann den Kopf nach hinten in eine Schale mit DMEM/F12 auf Eis (Abbildung 2). Wiederholen Sie die Schritte 5-7 für alle Köpfe und für alle DNA-Lösungen. Nach Abschluss electroporations, fügen ~ 1,5 ml Sauerstoff SFM Lösung für ein 4-Well Schale und halten auf dem Eis (eine auch für jeden einzelnen DNA-Lösung injiziert). Übertragen einem Kopf auf einem Seziertisch Gericht mit DMEM/F12, mit einem Netzhaut nach oben zeigt. Am ventralen Retina (oder gegenüberliegenden Seite Zielregion), verwenden feinen Pinzette zu kneifenund reißen ein Loch in den RPE. Stecken Sie ein Ende der Zange durch dieses Loch zu schälen RPE weg von der Netzhaut, die speziell auf die Linse-Retina-Kreuzung. Schneiden Sie nicht oder Beschädigung der Netzhaut, weil diese Netzhaut hervorrufen wird auf sich selbst während der Inkubation Zusammenbruch. Nach dem Entfernen RPE, verwenden Pinzette heraus zu knallen Netzhaut durch Kneifen des Sehnervs an der Basis der Netzhaut (lassen Sie die Linse intakt). Transfer retinae mit Sauerstoff versorgt SFM. Flip über Kopf, und wiederholen Sie für kontralaterale Auge. Führen Sie Schritt 9 für alle elektroporiert Köpfe. Inkubieren Netzhaut mit Sauerstoff SFM bei 37 ° C für 40-48 Stunden. Teil 3b: Ex-vivo-Elektroporation Netzhaut Ernte und Beschichtung von GFP + Retina-Explantaten (2 Tage post-Elektroporation) Übertragen Sie alle retinae aus einem Brunnen von Sauerstoff SFM in eine Petrischale mit Deckel DMEM/F12. Wählen Sie eine Netzhaut und Verwendung fluoreszierender Binokular zu GFP + (grün) Teil der Netzhaut zu visualisieren. Mit einem microscalpel und Pinzetten, zerlegen und entsorgen Sie die non-GFP + Teil der Netzhaut, so dass nur ein GFP + Stück Netzhaut bleibt. Es ist hilfreich, ständig zwischen fluoreszierenden und regelmäßige Lichtschalter in der Dissektion eine gezielte Auswahl der GFP + Netzhaut. Übertragen Sie die GFP + Netzhaut zu einem gut mit DMEM/F12. Wiederholen Sie Schritt 2 für alle Netzhaut von einem gut. Für jede DNA Zustand (jeweils verschiedene gut), verwenden Sie eine neue Petrischale und DMEM/F12-Medium. Diese GFP + retinae muss nun in kleinere retinale Explantate für die Beschichtung seziert werden. Unter einem Binokular, geschnitten großes Stück GFP + Netzhaut in kleinere Explantate mit einem microscalpel. Explantate sollte rechteckig sein, ~ 200-300 um in Länge und Breite. Sammeln Sie alle Explantate in einem gut mit DMEM/F12. Ein GFP + Stück Netzhaut sollten produzieren ~ 4-10 GFP + Netzhaut Explantate je nach Gewebe Größe. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle GFP + retinalen Regionen, die geerntet wurden. Nach der Vorbereitung aller GFP + Retina-Explantaten, fügen Sie 250 ul SFM + 0,4% Methylcellulose (bei 4 ° C) an Laminin-beschichtete Kulturschalen (siehe Teil 1). Transfer 4-8 GFP + Explantate auf der Kulturschale und nutzen Sie die Pinzette vorsichtig arrangieren die Explantate in ein Polygon, mit Explantate auf halbem Weg zwischen dem Zentrum und dem Rand der Schüssel befindet. Bestimmen Sie, welche Seite der Explantation ist die RGC-Schicht. Manchmal RPE Kristalle bleiben an der äußeren Netzhaut, was darauf hinweist, dass der gegenüberliegenden Seite der RGC-Schicht ist. Darüber hinaus die RGC Seite hat in der Regel einige Zelltrümmer, dass in der richtigen Explantation Orientierungshilfe können. Mit der RGC-Schicht nach unten, Verwendung einer Pinzette fest zu drücken Sie die Mitte der Explantation, so dass es zum Deckglas haften bleibt. Eine Vertiefung in dem Explantat aus der Zange kann sichtbar sein, das ist normal. Nach dem Plattieren alle Explantate auf einer Kulturschale, um 37 ° C Inkubator übertragen. Retinal Axone ersten 4-6 Stunden nach dem Ausplattieren beobachtet und Explantate bleiben für einige Tage gesund, aber signifikante Überwucherung kann nach 24 Stunden erfolgen. Explantate können für eine Vielzahl von in-vitro-Assays verwendet werden, mit 4% PFA für 30 Minuten und immungefärbt (Abbildung 2). Border Assay Alternativ Transfer 4 GFP + Explantate auf ein Gericht, das für die Grenze Assay vorbereitet wurde (siehe Teil 1). Ordnen Sie die Explantate in eine vertikale Linie in der Mitte der Schale, die Angleichung der Lage der Grenze. Unter einem fluoreszierenden Präpariermikroskop, Platte der Explantate, so dass sie ~ 50-150 mm von der Fluoreszenz-Grenze. Inkubieren Gerichte bei 37 ° C für 24 Stunden, so dass genügend Zeit für RGC Axone Grenze Substrat zu erreichen. Explantate können in 4% PFA für 30 Minuten behoben werden, gefolgt von Immunfärbung (Abbildung 2). Repräsentative Ergebnisse