Não-radioativo In situ Protocolo de hibridação Aplicável para a Noruega Spruce e uma variedade de espécies de plantas

Este mRNA não-radioativo em protocolo de hibridização in situ é otimizado para tecidos Noruega spruce e descritos em detalhe. É baseado em uma Arabidopsis / colza no protocolo de hibridização in situ otimizado em nossos grupos, que por sua vez é baseado em protocolos da Meyerowitz e laboratórios de irlandeses e otimizado por Vivian irlandês, Lincoln Cindy e Long Jeff entre outros 1-4. PROCEDIMENTO 1. FIXAÇÃO e incorporação de Para fornecer tecidos retenção de RNA devem ser fixados e embebidos em cera antes de uma experiência in situ é realizada. A fixação e incorporação é um passo crítico, pois materiais mal fixa pode dar um sinal de baixa ou indetectável mesmo que o mRNA é altamente abundante. Os tecidos são desidratadas, limpas e embebidos em cera em mudanças graduais para evitar danos aos tecidos. Também para evitar o encolhimento e inchaço das células de 0,85% NaCl é adicionada ao etanol primeiro passos na desidratação dos tecidos Noruega abeto. É possível deixar de fora o NaCl no etanol (por exemplo, é deixado de fora no protocolo de Arabidopsis / colza). A etapa de desidratação durante a incorporação pode ser realizada no gelo para manter a atividade RNase no mínimo ou no 4 ° C. Neste protocolo a solução correção de 4% paraformaldeído contém glutaraldeído 0,25%, o que é suposto dar uma melhor retenção de RNA, apesar de que alguns argumentam que ele provavelmente não faz diferença (por exemplo, é deixado de fora no protocolo de Arabidopsis / colza). Mais provável de qualquer fixação padrão e protocolo de incorporação pode ser usado. Como pode ser visto abaixo da incorporação spruce Noruega difere ligeiramente do protocolo de Arabidopsis / colza. 1.1 Dia 1 Coleta de material vegetal e fixação paraformaldeído Coletar o material vegetal de interesse e dissecá-lo, se necessário. Manter os tecidos em gelo e colocá-los em solução gelada fix (veja receitas abaixo) direta ou o mais rapidamente possível. NB! Manter no gelo o tempo todo! Aplicar vácuo para as amostras até que o paraformaldeído começa a borbulhar. Manter o vácuo por até três horas (por exemplo 2 x 15 min para Arabidopsis e tecidos florais de colza ou uma hora para cones Noruega spruce masculino) e liberar o vácuo devagar. Os tecidos devem afundar após a infiltração de vácuo do fixador, mas para certos tecidos que contêm uma grande quantidade de ar que não é possível (flores Arabidopsis, por exemplo). Um pedaço de gaze pode ser usada para fazer os tecidos permanecer no fixador. Substituir o fixador e incubar a 4 ° C durante a noite (~ 12-16 horas) agitando. Opção 1 NB! Noruega versão incorporação enfeitar a seguir (passos 4-8). Faça tubos de cintilação certeza ou frascos de vidro são usadas, pelo menos na etapa 5. Dia 2 1,2 Desidratação NB! Noruega versão incorporação abeto. 0,85% NaCl 30 min com gelo 50% EtOH + NaCl 0,85% 90 min com gelo 70% EtOH + NaCl 0,85% 90 min com gelo Pausa! É possível parar por aqui e armazenar os tecidos em 70% EtOH + NaCl 0,85% a +4 ° C durante vários meses. 85% EtOH + NaCl 0,85% 90 min 4 ° C EtOH 95% (+ eosina) 90 min 4 ° C NB! Eosina é adicionado para manchar os tecidos rosa tornando-os mais fáceis de detectar, durante a incorporação e de corte, mas pode ser excluída. 100% EtOH (+ eosina) 90 min 4 ° C 100% EtOH (+ eosina) durante a noite 4 ° C 1,3 Dia 3 desidratação e incorporação NB! Noruega versão incorporação abeto. <ol s= tart "5"> 100% EtOH (+ eosina) 2 h temperatura ambiente EtOH 50% + 50% Histoclear II 1 h temperatura ambiente 100% Histoclear II 1 h temperatura ambiente 100% Histoclear II 1 h temperatura ambiente 50% Histoclear II + Histowax 50% durante a noite 40-50 ° C NB! Na última etapa a concentração de Histowax não é crucial, basta derramar em alguns chips de cera. Dia 4 1,4 Incorporação NB! Noruega versão incorporação abeto. 100% Histowax derretida 60 ° C (Manhã e noite Alterar) 1,5 Dia 5 Incorporação NB! Noruega versão incorporação abeto. 100% Histowax derretida 60 ° C (Manhã e noite Alterar) 1,6 Dia 6 Incorporação NB! Noruega versão incorporação abeto. 100% Histowax derretida 60 ° C (Manhã e noite Alterar) NB! É ok se a cera, ocasionalmente, é alterada uma vez por dia, mas depois leva dois dias para completar um dia de mudanças. A mudança de cera também pode continuar por mais dois dias sem nenhum problema. Isto é recomendado para grandes amostras uma vez que ajuda a infiltração da cera no centro desses tecidos. Opção 2 NB! Arabidopsis / colza versão incorporação abaixo (passos 4-8). Dia 2 1,2 Desidratação NB! Arabidopsis / versão incorporação de colza. NB! Todos os passos a +4 ° C e agitando, se não for indicado outra coisa. 1x PBS 30 min 1x PBS 30 min 30% EtOH 60 min 40% EtOH 60 min 50% EtOH 60 min 60% EtOH 60 min 70% EtOH 60 min Pausa! É possível parar por aqui e armazenar os tecidos em EtOH 70% no 4 ° C durante vários meses. 85% EtOH 60 min EtOH 95% (+ eosina) durante a noite NB! Eosina é adicionado para manchar os tecidos rosa tornando-os mais fáceis de detectar, durante a incorporação e de corte, mas pode ser excluída. 1,3 Dia 3 Desidratação e embedding NB! Arabidopsis / versão incorporação de colza. NB! Todas as medidas à temperatura ambiente e agitando, se não for indicado outra coisa. 100% EtOH (+ eosina) 30 min 100% EtOH (+ eosina) 30 min 100% EtOH (+ eosina) 60 min 100% EtOH (+ eosina) 60 min NB! Transfira o tecido para frascos de cintilação ou outras (vidro) frascos. EtOH 75% + 25% Histoclear II 30 min EtOH 50% + 50% Histoclear II 30 min EtOH 25% + 75% Histoclear II 30 min 100% Histoclear II 60 min 100% Histoclear II 60 min 100% Histoclear II + ¼ volumes de chips Histowax durante a noite (sem agitação) NB! Na última etapa a concentração de Histowax não é crucial, basta derramar em alguns chips de cera. Dia 4 1,4 Incorporação NB! Arabidopsis / versão incorporação de colza. Coloque os frascos com os tecidos na 42 ° C até que a cera derreter completamente fichas. Em seguida adicione ¼ do volume de chips de cera e deixe-os derreter completamente. Mover-se para 60 ° C e deixe os frascos por várias horas. Finalmente, substituir a cera / Histoclear II com cera derretida e recém-incubar durante a noite com 60 ° C. 1,5 Dia 5 Incorporação NB! Arabidopsis / versão incorporação de colza. 100% Histowax derretida 60 ° C (Manhã e noite Alterar) 1,6 Dia 6 Incorporação NB! Arabidopsis / versão incorporação de colza. 100% Histowax derretida 60 ° C (Manhã e noite Alterar) NB! No protocolo de Arabidopsis / colza (comparado com o abeto da Noruega protocol) há um Dia 7 Incorporação da mesma forma como no dia 06/05, ou seja, 100% Histowax derretidos em 60 ° C e mudar manhã e à noite NB! É ok se a cera, ocasionalmente, é alterada uma vez por dia, mas depois leva dois dias para completar um dia de mudanças. A mudança de cera também pode continuar por mais dois dias sem nenhum problema. Isto é recomendado para grandes amostras uma vez que ajuda a infiltração da cera no centro desses tecidos. 1,7 Dia 7 Embedding (Dia 8 no protocolo de Arabidopsis / colza) (Film! Detalhes técnicos são mostrados no filme) Pré-aqueça pratos petri e / ou moldes em +60 ° C. Vire sobre um prato quente (60 ° C) e certifique-se Histowax derretido está disponível. Despeje a tecidos e Histowax derretido em uma placa de Petri (ou um molde) colocada sobre a placa quente. Adicione mais Histowax para que os tecidos são cobertos. Aqueça um par de pinças e distribuir os tecidos uniformemente no prato. Encha o prato de petri (ou bolor). Se a cera endurece antes que os tecidos estão na posição certa, aquecê-lo novamente ou remover a cera endureceu com o par de pinças aquecida. Deixe a cera bloco endurecer em temperatura ambiente antes de colocá-lo em 4 ° C. É melhor fazer blocos de cera em vez de incorporar vários tecidos com muita força desde o bloco de cera pode rachar quando as peças são cortadas durante o corte. Pausa! Guarde-o em quatro edeg; C. Os tecidos são estáveis ​​durante anos. NB! Trabalho livre de RNase esta etapa e partir. Use luvas, DEPC de tratamento de água MilliQ, buffers, copos etc, buffers autoclave e asse vidro etc, quando apropriado. 2. Seccionamento (detalhes Film! técnicas são mostradas no filme) Ligar duas placas quentes (60 ° C e 42 ° C) e certifique-se Histowax derretido está disponível. Aqueça um bisturi e cuidadosamente cortar um bloco de cera de tecido da placa de Petri (pode rachar se um é muito violento), ou removê-lo do molde. Quando um bloco de cera única foi separada, de forma a peça no tamanho certo e de forma para facilitar o corte no micrótomo. A peça de cera deve ter um extra de cera "calcanhar" por baixo do tecido para que ele possa ser anexado ao titular bloco. Aqueça o titular bloco eo calcanhar no prato quente (60 ° C) e fundi-las em conjunto. Pode ser necessário colocar uma gota de Histowax II para fazer a fusão estável. Deixá-lo endurecer a +4 ° C. Corte o bloco de cera em 6-8 mM de espessura conectados em uma longa fita usando um micrótomo. NB! Este será mais fácil se o bloco de cera é, entreposto frigorífico ou seja, o bloco de cera no 4 ° C e trazê-lo da geladeira quando se inicia o corte. Ele também pode ser benéfico para manter o frio faca. Estudar as fitas de seções em uma lupa e marcar os únicos a ser usado. Coloque RNase MilliQ água nos slides (Probe-On Plus da Fisher Biotecnologia, que são pré-limpeza e cobrados). Corte a fita em pedaços pequenos e colocá-los ("back" ou no lado "brilhante" para baixo) nos slides. Os slides com as fitas devem ser colocadas em uma placa de 42 C °. A fita deve achatar (isto é importante!) Na água. Deixe as seções sentar por alguns minutos e depois usar um papel Kimwipe / tecido para drenar a água. Deixar as lâminas sobre a placa por 1-2 horas. Incubar as lâminas em 42 ° C durante a noite para que os tecidos aderir a slides. Pausa! É recomendável usar as seções o mais rapidamente possível, mas eles podem ser armazenados em caixas fechadas seco com dessecante até vários dias a +4 ° C. 3. O MAKING OF SONDAS Hibridização in situ detecta expressão usando uma sonda marcada específica para um determinado mRNA. A sonda, que é na maioria das vezes um pedaço de RNA complementar, pode ser marcado com digoxigenina, DIG. DIG é uma molécula pequena, que pode ser conectado a uridina e, assim, incorporado na sonda de RNA e depois detectados usando DIG anticorpos específicos. A concepção e construção da sonda é o passo mais crítico em um RNA no experimento de hibridização in situ. Cuidados devem ser tomados para garantir que a sonda tem uma alta especificidade e é rotulado com UTPs de alta qualidade. Às vezes, a temperatura de hibridação e / ou comprimento de reação tem que ser ajustado para sondas específicas. Como sempre, os cuidados devem ser tomados para evitar a contaminação RNase. Antes de rotulagem, isolar um modelo de acordo com os protocolos padrão, por exemplo, utilização de clones de cDNA, PCR-fragmentos, e linearizar o modelo. Fragmentos de sentido e antisense são isoladas e amplificado a partir do modelo utilizando primers gene específico. Para fragmentos de PCR amplificados não usam enzimas que produzem overhangs 3 '. Para todos os fragmentos de uma saliência T7 (ou SP6 ou T3) é adicionada usando primers carregando a T7-seqüência ou usando um vetor com um promotor T7. O sentido (mRNA ou (- vertente)) sonda têm a mesma sequência do mRNA alvo e não hibridizam ao mRNA alvo, enquanto o antisense (anti-mRNA ou (+) fio) da sonda tem a seqüência complementar e, portanto, hibridizar o alvo dando o sinal de interesse. A sonda sentido é usado como um controle negativo e nenhum sinal será obtida se o experimento funcionou corretamente. Um controle positivo também é necessário, por exemplo, uma sonda que detecta um gene de manutenção da casa. A maioria dos slides deve ser hibridizado com sondas antisense, enquanto apenas alguns slides deve ser hibridizado com as sondas de controle diferentes. 3,1 rotulagem Probe usando transcrição in vitro Reagentes do RNA DIG Labeling Kit (SP6/T7; 11175025910, Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) ou similares são usados ​​quando a rotulagem das sondas. A reação 20 l descrito aqui deve render ~ mcg 10 de DIG marcado RNA. Fazer uma transcrição in vitro para incorporar nucleotídeos rotulados. Adicionar os seguintes reagentes a um tubo (manter no gelo): Ingrediente volume / quantidade 10 x mistura rotulagem NTP 2 l 10 x tampão de transcrição 2 l Protector RNase inibidor 1 ml (20U) RNA polimerase T7 (SP6 ou T3) 2 l DNA molde (500-1000 ng) mL x RNase MilliQ-água y mL, para um volume final de 18 mL Misture a mistura de rotulagem NTP, tampão de transcrição, RNase inibidor (NB! se a sonda é curto, por exemplo <500bp, você pode aumentar a concentração de inibidor de RNase 40U), DNA polimerase modelo, e água e, em seguida, brevemente centrífuga. Incubar a mistura de reacção a 37 ° C por 2 horas (NB! se a sonda é curto, por exemplo <500bp, aumente o tempo de reação a 4-6 horas). Adicione 2 mL DNase I e incubar a 37 ° C por 15 min. Parar a reacção adicionando 2 mL 0,2 M EDTA (pH 8,0). Verifique o produto em gel. Precipitar a sonda, adicionando 2,5 mL de 4 M LiCl e 75 mL de> 99,5% de etanol. Misturar bem e incubar a -20 ° C durante a noite (NB! Não use tRNA como operadora. Ao invés disso use glicogênio ou acrilamida de acordo com os fabricantes). Centrifugação (13 000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C e remover o sobrenadante. Lave o pellet (pelo menos 10 min 13 000 rpm), duas vezes em etanol 70% (~ 150-300 mL). Remover o sobrenadante e deixar o pellet secar. Ressuspender a sonda em 30 de água livre de RNase mL por 1-2 horas no gelo. Pausa! A sonda pode ser armazenado a -20 ° C por mais de um ano. NB! Salvar 0,5 mL de amostras a partir do passo 21 (antes da transcrição in vitro), passo 23 (antes do tratamento DNase), passo 24 (após o tratamento DNase, mas antes da precipitação) e 1 mL da amostra a partir do passo 27 (quando a sonda foi ressuspenso). Executar os exemplos em um gel TBE nondenaturating 1%. Se a reação DNase tem trabalhado adequadamente o modelo de banda irá desaparecer. A transcrição in vitro deve gerar uma banda de RNA de espessura de aproximadamente o tamanho correto. Se você ver várias bandas, denaturate as amostras a 80 ° C por 5 minutos seguido de resfriamento em gelo antes de carregar. Se a recuperação a partir do passo 27 parece ruim pode ser assim porque a sonda não foi ressuspenso bem. Incubar a RNA em 55 minutos 50-10 ° C para obtê-lo na solução. 3,2 Hidrólise de sondas de longa NB! Se a sua sonda é maior do que 150 pb que deve ser reduzida para 50-150 bp para dar um sinal de alta, devido a uma melhor penetração. A sonda pode ser quimicamente degradados em um tampão carbonato (pH 10,2). Se a sonda é do tamanho correto pular a etapa de hidrólise, mas lembre-se de adicionar uma formamida volume, ou seja, 30 mL, para a sonda. Prepare 0,2 M de bicarbonato de sódio (NaHCO 3) e carbonato de sódio 0,2 M (Na 2 CO 3). Ambos devem ser frescos. Teste os dois buffers através da mistura de 5 ml H 2 O, 2 ml 0,2 M NaHCO 3 e 3 ml 0,2 M Na 2 CO 3. O pH deve ser 10,2 ~. Calcular o tempo de incubação: Tempo de incubação (em minutos) = (L 0 L-f) / (K * L * L 0 f) L 0 = comprimento inicial da sonda em kb L f = comprimento final da sonda em kb por exemplo = 0,100 kb K = taxa constante de hidrólise = 0,11 kb-1min-1 Hidrolisar a metade de sua sonda, guardar o resto para mais tarde. Diluir sonda para 50 ul com água livre de RNase e adicionar 20 mL 0,2 M NaHCO 3 (add primeiro) e 30 mL 0,2 M Na 2 CO 3. Misturar e incubar a 60 ° C para o tempo de incubação calculado. Pare a reação adicionando 10 ml de 1 M pH 4,7 NaOAc. Precipitar a sonda, adicionando 10 ml 4 M LiCl 2 e 300 mL ethanol (NB! glicogênio Use ou acrilamida como portador, se necessário). Incubar a -20 ° C durante a noite. Centrifugação (13 000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C e remover o sobrenadante. Lave o pellet duas vezes em etanol 70% (~ mL 300). Centrifugação (13 000 rpm), pelo menos, 10 min em cada lavagem a +4 ° C. Remover o sobrenadante e deixar o pellet secar. Ressuspender a sonda em 30 mL RNase MilliQ-água. Adicionar um formamida volume, ou seja, 30 mL, para a sonda. Pausa! A sonda pode ser armazenado a -20 ° C por mais de um ano. NB! Take 2 mL da sonda unhydrolyzed e 2 mL da sonda hidrolisada (antes da formamida é adicionado) e verificar um gel TBE nondenaturating 1%. Deve haver uma diferença de tamanho entre as duas amostras. As sondas podem precisar ser desnaturado a 80 ° C por 5 minutos seguido de resfriamento em gelo antes de carregar. 4. Hibridização In Situ (detalhes Film! técnicas são mostradas no filme) Certifique-se que todas as soluções são RNase free! Não é necessário tratar-DEPC tudo, mas usar pelo menos MilliQ autoclavada água. Certifique-se que todos os vidros são aquecidos a 200 ° C durante a noite ou, pelo menos, durante 5 horas. Tratar recipientes de plástico e mexa bares com NaOH 0,1 M com agitação durante a noite. Lavar as embalagens de plástico várias vezes com MilliQ autoclavada-água (~ 500 ml / recipiente). É fundamental lavar os recipientes com cuidado para evitar traços de NaOH que possa perturbar a hibridização. DEPC de tratar todas as soluções estoque, exceto o Tris-buffers. Verifique todas as soluções etc antes de iniciar o experimento para garantir que tudo está disponível. Até a etapa 61 (exceto passos 51-52) mantemos os slides em um rack, que é facilmente movidos entre recipientes. 4.1 No pré-tratamento seção situ Deparaffinize / desidratar seções: 2x 10 min Histoclear II (use recipientes de vidro) 2x 1-2 min EtOH 100% 1-2 min EtOH 95% 1-2 min EtOH 90% 1-2 min EtOH 80% 1-2 min EtOH 60% 1-2 min EtOH 30% 1-2 min H 2 O Lavar as lâminas de 15-20 minutos em 2x SSC na sala temp (NB! Prepare o paraformaldeído usado na etapa 42, durante o tempo de incubação). Tratar os tecidos por 30 min com proteinase K a 37 ° C com agitação suave (por exemplo, 1 mg / ml para a Arabidopsis / colza e 3 mg / ml para a Noruega spruce). Mistura e pré-aquecer a 37 ° C 100 mM Tris pH 8 e 50 mM EDTA. Adicionar proteinase K imediatamente antes de tratar os slides. NB! O tratamento proteinase K precisa ser otimizado, dependendo do tecido, espécies de plantas e idade. (NB! Prepare a trietanolamina usado na etapa 45, durante o tempo de incubação). Tratar os slides durante 2 min com 2mg/ml glicina em 1x PBS à temperatura ambiente. (NB! Misture a glicina com PBS um dia antes de usá-lo para garantir que a glicina é devidamente dissolvido). Lavar as lâminas durante 2 minutos em PBS 1x à temperatura ambiente. Lavar as lâminas durante 2 minutos em PBS 1x à temperatura ambiente. Incubar as lâminas por 10 minutos com 4% (w / v) paraformaldeído (feito fresco) em 1x PBS pH 7 à temperatura ambiente. Use recipiente de vidro. Lavar as lâminas por 5 minutos em PBS 1x à temperatura ambiente. Lavar as lâminas por 5 minutos em PBS 1x à temperatura ambiente. (Dispense anidrido acético na solução no passo 45). Incubar as lâminas por 10 minutos em 0,1 M trietanolamina (pH feitos, frescos 8) e anidrido acético à temperatura ambiente. Lavar as lâminas por 5 minutos em PBS 1x à temperatura ambiente. Lavar as lâminas por 5 minutos em PBS 1x à temperatura ambiente. Desidratar: 30 seg EtOH 30% 30 seg EtOH 60% 30 seg EtOH 80% 30 seg EtOH 90% 30 seg EtOH 95% 2x 30 seg EtOH 100% Pausa! É possível parar aqui e armazenar os slides em um recipiente com uma pequena quantidade de etanol na parte inferior a +4 ° C por várias horas. 4.2 Em hibridização in situ (Film! Detalhes técnicos são mostrados no filme) Decidir qual slides para usar com as sondagens, não se esqueça de usar os dois sentidos e sondas antisense, bem como um controle positivo. (NB! ProbeOn Além disso slides de Biotecnologia Fisher tem uma cobertura branca que lhes permite ser imprensado em pares durante as etapas de hibridização / detecção do protocolo.) A mesma sonda com a mesma concentração deve ser usado em um par slide específico. Determine solução de hibridização quanto fazer com base no número total de pares de slides. Pré-aqueça o sulfato de Dextran em +60 ° C. A solução de hibridação é muito viscoso do sulfato de dextrano. Colocar a solução de hibridização em 60 ° C e será mais fácil de manusear. Secar as lâminas sobre papel toalha limpo ou Kimwipe / tecido papéis antes de a sonda é aplicada. Os slides devem estar completamente secos. Para cada par de slides adicionar a sonda. É importante testar as concentrações de sonda diferentes (por exemplo, 0,5, 2 e 4 mL) para encontrar a concentração ideal antes do experimento real é pré-formada. Solução de hibridização 5 pares de diapositivos 10 pares de diapositivos 15 pares de diapositivos 20 pares de diapositivos 10x em sais situ 100 l 200 mL 300 ml 400 mL formamida deionizada 400 mL 800 mL 1200 mL 1600 mL 50% de sulfato de Dextran (+60 ° C) 200 mL 400 mL 600 mL 800 mL 50x de solução Denhardt 20 l 40 mL 60 mL 80 mL tRNA (100mg/ml) 10 ml 20 l 30 mL 40 mL H 2 O (DEPC tratados) 70 mL 140 mL 210 mL 280 mL Volume total 800 mL 1600 mL 2400 mL 3200 mL Diluir a sonda em água MilliQ-RNase-free para um volume final de 20 mL. Adicionar um volume (mL ou seja 20) formamida à sonda dando um volume total de 40 mL. Aqueça a sonda a 80 ° C por 2 minutos. Colocar no gelo por 2 min. Spin down. Manter a sonda no gelo. Esta sonda-mistura é suficiente para um par de slides. Multiplicam de acordo com o número total de pares de slides para a sonda específica. Adicione 160 ml de solução de hibridização para cada par de slides dando um volume final de 200 mL (ou seja, 160 mL de solução de hibridização da sonda + 40 mL) para cada par de slides. Mix sem gerar bolhas. Aplicar a sonda a um slide e, lentamente, fundir os dois slides juntos. (Imprensando NB! só pode ser feito com Probe-On slides Plus ou slides equivalente. Se slides sem cobertura são usados ​​use lamínulas em vez de sanduíche). Elevar slides acima toalhas de papel molhado em um recipiente de plástico (que veda bem) usando pipetas de plástico. Hibridizar 50-55 ° C durante a noite (12-16 horas). 4.3 Na hibridização in situ de pós (Film! Detalhes técnicos são mostrados no filme) Prepare o de hibridização in situ de pós pelo aquecimento ~ 2 L 0.2x SSC (+55 ° C) e ~ 2 L 1x NTE (+37 ° C) durante a noite. Mais SSC e NTE são necessários se o tratamento RNase (57-59 passos abaixo) é executada. Dip cada par deslizar quente 0.2x SSC (veja acima) para separar e enxaguá-los. Em seguida, colocá-los em um rack em um recipientecom água morna 0.2x SSC. Lavar as lâminas por 60 min em 0,2 x SSC com agitação suave a +55 ° C. (NB! Prepare a solução de bloco Boehringer usado na etapa 63, durante o tempo de incubação). Repita o lava-0.2x SSC por 60 min. (NB! Se o passo RNase é realizada deixar o degelo RNase durante esta incubação, se não continue com a etapa 60.) Opcional: Lavar as lâminas por 5 minutos em água morna 1x NTE (veja acima) a +37 ° C com agitação suave. Opcional: Repita o lava-NTE 1x quente durante 5 min a 37 ° C com agtation gentil. Opcional: Trate os slides com RNase (20 mg / ml de RNase A em 1x NTE) por 30 min a 37 ° C com agitação suave. Em seguida, lave por 5 min no NTE 1x a +37 ° C com agitação suave. Repita a lavagem NTE 1x. Lavar as lâminas por 60 min em 0,2 x SSC a 55 ° C com agitação suave. (NB! Prepare a solução de bloco usado nas etapas de 64-65 e 67, durante o tempo de incubação). Lavar as lâminas por 5 min em 1x PBS à temperatura ambiente (Pause! Você pode armazenar em slides 1XPBS a +4 ° C durante a noite se você quiser continuar no dia seguinte.) Colocar as lâminas no fundo de um recipiente de plástico grande com o lado da amostra. Incubar as lâminas com um bloco% Boehringer em 100 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl por 45 min em temperatura ambiente com agitação suave. Apenas cobrir as lâminas com a solução de bloqueio. Decantar a solução de bloqueio, enquanto as lâminas ainda estão no recipiente de plástico ou coloque as lâminas em um novo recipiente. Quando vazar fora a solução que o slides geralmente aderir ao recipiente de plástico, mas certifique-se que eles não caem fora do recipiente. Substitua a solução de bloco Boehringer com BSA 1,0% em 100 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,3% Triton X-100. Realizar a incubação como na etapa 63. Diluir os anticorpos anti-dig (1:1250, ou seja, 8 mL de anticorpos em 10 ml BSA) na solução de BSA / Tris / NaCl / Triton das 64 etapas. Faça uma poça de solução de anticorpos em um plástico pesam prato. Sanduíche de slides em conjunto para permitir que as forças capilares para puxar para cima a solução. Escorra em Kimwipe / lenço de papel e repita, para tentar evitar bolhas. Elevar slides acima toalhas de papel molhado no recipiente plástico e deixe os slides para sentar-se à temperatura ambiente por 2 horas. Dreno slides sobre Kimwipe / papel de seda e separado. Lugar no fundo do recipiente de plástico como na etapa 63. Lave 4x na solução BSA / Tris / NaCl / Triton. 15 min cada vez, agitação suave na temperatura ambiente. 10 min 100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl 2. Lugar no fundo do recipiente de plástico como na etapa 63. Dip de slides em Tris pH 9.5/NaCl/MgCl dois solução para garantir que todas as de detergente é lavado. Fazer sanduíches e elaborar solução de azul ocidental como em 65. Repetir uma vez. Colocar as lâminas em recipiente plástico acima toalhas de papel molhado na escuridão total (embrulhe em papel alumínio) para 1-5 dias em temperatura ambiente. Verifique após 6, 12 e 24 horas, em seguida, uma vez a cada dia. Slides Escorra, lave em 1xTE para parar a reação. Coloque em lamínulas antes do slides são examinados em microscópio. Os slides podem ser salvos em 1x TE por vários meses, mas tirar fotos o mais rapidamente possível. RECEITAS / SOLUTIONS STOCK NB! Use RNase MilliQ água, tanto quanto possível, por exemplo, tratar-DEPC MilliQ-água (Adicionar DEPC 0,1%. Deixe Autoclave durante a noite. (20 minutos a 15 psi, ou seja, 1,05 kg / cm 2, no ciclo de líquido) ou utilizadas em pelo MilliQ autoclavada água. Ao preparar buffers e soluções estoque também é possível dissolver RNase sais etc DEPC em água tratada, em vez de DEPC-tratamento da buffers e soluções de ações próprias. Se você não tratar a água DEPC- , buffers e ações de soluções, pelo menos esterilizar autoclave ou filtrá-los. Pausa! Buffers loja e estoque de soluções em temperatura ambiente, se não for indicado outra coisa. NB! Você pode encontrar muitos dos buffers, bem como dicas sobre como fazê-los em Clonagem Molecular (Sambrook, J., e DW Russell. 2001. Clonagem Molecular Um Manual de Laboratório. 3 ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, EUA). Anidrido acético 0,1 M em trietanolamina (pH 8, volume: 800 ml). Ingrediente volume / quantidade concentração final Trietanolamina 10,4 ml 0,1 M trietanolamina MilliQ-água 786,4 ml volume final de 800 ml HCl 3,2 ml dando pH8 Anidrido acético 4,8 ml 0,6% Para fazer trietanolamina 0,1 M, pH 8,0, diluir 10,4 ml de trietanolamina em 786,4 ml de H 2 O e adicionar 3,2 ml de HCl para trazer o pH para 8,0 (verifique com indicador de pH). Elevar o porta-lâminas com quebrado pipetas de plástico 10 ml ou similar em um recipiente de trietanolamina com uma barra de agitação no fundo. Dispensar 4,8 ml de anidrido acético na trietanolamina alguns minutos antes de colocar em slides de modo que é bem misturada. NB! Fazer a trietanolamina 0,1 M fresco e anidrido acético adicionar um pouco antes de incubação. NB! Use recipiente de vidro. Trietanolamina tampão tem que ser usado porque o anidrido acético é instável na água. Gel de agarose (1%) em 1 x TBE (volume: 100 ml) Ingrediente volume / quantidade concentração final Agarose 1 g 1% 1 x TBE até 100 ml Mix agarose com 1 x TBE. Calor / ferver até que a agarose derreter. Lançar um gel. Executar o gel em um 1 x TBE. Sulfato de dextrano Diluir 5 g de sulfato de Dextran a 10 ml com DEPC tratados MilliQ-água (ou seja, 50% (w / v)) e dissolver em 60 ° C. Pausa! Armazenar a -20 ° C. 0,5 M EDTA pH8.0 (Titriplex III, volume 500 ml) Ingrediente volume / quantidade concentração final EDTA (372,24 g / mol) 93,06 g 0,5 M EDTA MilliQ-água até 500 ml NaOH ~ 10 g pellets dando pH 8,0 DEPC 0,5 ml 0,1% DEPC Dissolver o EDTA na água (ocorre em pH 8,0), ajustado a um volume final de 500 ml. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave. Fix solução / fixador (passos 1-3, 42) – 4% (w / v) paraformaldeído em PBS 1x, pH 7,0 (650 ml) Ingrediente volume / quantidade concentração final MilliQ-água 585 ml PBS 10x 65 ml 1x PBS NaOH 10M 520 mL pH ~ 11 dando Paraformaldeído 26 g 4% HCl concentrado 449 mL pH ~ 7 dando Água de amassamento, PBS e NaOH e calor para 60-70 ° C (a temperatura eo pH elevado irá torná-lo mais fácil de dissolver o paraformaldeído. Adicionar (em capela) paraformaldeído. Quando a solução cancelou colocá-lo no gelo e ajustar o pH para 7,0 pela adição de 449 mL de HCl concentrado. NB! Faça fresco. NB! No glutaraldeído protocolo spruce foi adicionado para uma concentração final de 0,25%, ou seja, 6,5 ml de glutaraldeído 25% para o volume total de 650 ml ou 10 ml de glutaraldeído 25% para o volume total de 1000 ml (lembre-se de reduzir a água com um igual volume). NB! Adicione algumas gotas de Tween 20 e / ou Triton X-100, após o pH é ajustado, para reduzir a tensão superficial para facilitar a fixação nos passos 1-3. NÃO USE EM PASSO 42! NB! Ao fixar tecidos da planta um volume menor (por exemplo, 100-200 ml) de fixador é geralmente necessário. 10x em sais situ (volume 100 ml) Ingrediente volume / quantidade concentração final 5 M NaCl 60 ml 3M NaCl 1 M pH Tris-Cl 8,0 10 ml 0,100 M Tris 1 M Na fosfato pH 6,8 10 ml 0,100 M Na Fosfato 0,5 M EDTA 10 ml 0,050 M EDTA MilliQ-água até 100 ml Misture um tampão fosfato com pH 6.8 Na (46,3 ml 1 M Na 2 HPO 4 + 53,7 ml 1 M NaH 2 PO 4). Mix NaCl, Tris, Na tampão fosfato, EDTA e água. Autoclave. Pause! Armazenar a -20 ° C. 4 M LiCl 2 (cloreto de lítio, volume: 100 ml) Ingrediente volume / quantidade concentração final LiCl 2 (42,39 g / mol) 16,956 g 4M LiCl 2 MilliQ-água até 100 ml DEPC 0,1 ml 0,1% DEPC Dissolver LiCl 2 em água, ajustar a um volume final de 100 ml. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave. Pausa! Guarde-o em 4 ° C. 1 M MgCl 2 · H 2 O (cloreto de magnésio, volume: 100 ml) Ingrediente volume / quantidade concentração final MgCl 2 · H 2 O (203,30 g / mol) 20,33 g 1 M MgCl 2 · H 2 O MilliQ-água até 100 ml DEPC 0,1 ml 0,1% DEPC Dissolver MgCl 2 na água, ajustar a um volume final de 100 ml. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave. NB! MgCl 2 é muito higroscópico. Não guarde frascos abertos por longos períodos de tempo. 5 M NaCl (cloreto de sódio, volume: 1 l) Ingrediente volume / quantidade concentração final NaCl (58,44 g / mol) 292,2 g 5 M NaCl MilliQ-água até 1l DEPC 1 ml 0,1% DEPC NaCl dissolver na água, ajustar a um volume final de 1 l. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave. 1 M pH 4,7 NaOAc (acetato de sódio, volume: 100 ml) Ingrediente volume / quantidade concentração final NaOAc (82,03 g / mol) 0,8203 g 1 M NaOAc MilliQ-água até 100 ml Ácido acético dando pH 4,7 DEPC 0,1 ml 0,1% DEPC Dissolver NaOAc na água. Ajustar o pH para 4,7. Adaptar a um volume final de 100 ml. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave. 0,2 M Na 2 CO 3 pH11.4 (carbonato de sódio, volume: 10 ml) Ingrediente volume / quantidade concentração final Na 2 CO 3 </sub> 0,21198 g 0,2 M Na 2 CO 3 pH = 11,4 MilliQ-água até 10 ml Dissolver Na 2 CO 3 em água; ajustar a um volume final de 10 ml. O pH deve ser 11,4. NB! Faça fresco. 0,2 M NaHCO 3 pH8.2 (bicarbonato de sódio, volume: 10 ml) Ingrediente volume / quantidade concentração final NaHCO 3 0,16802 g 0,2 M NaHCO 3: pH = 8,2 MilliQ-água até 10 ml Dissolver NaHCO 3 em água; ajustar a um volume final de 10 ml. O pH deve ser 8.2. NB! Faça fresco. 1 M Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O (ml de volume 500) Ingrediente volume / quantidade concentração final Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O (177,99 g / mol) 88,995 g 1 M Na 2 HPO 4 MilliQ-água até 500 ml DEPC 0,5 ml 0,1% DEPC Dissolver Na 2 HPO 4 em água, ajustar a um volume final de 500 ml. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave. 1 M NaH 2 PO 4 · H 2 O (ml de volume 500) Ingrediente volume / quantidade concentração final NaH 2 PO 4 · H 2 O (137,99 g / mol) 68,995 g 1 M NaH 2 PO 4 MilliQ-água até 500 ml DEPC 0,5 ml 0,1% DEPC Dissolver NaH 2 PO 4 em água, ajustar a um volume final de 500 ml. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave. NTE 5x (volume total: 1l) Ingrediente volume / quantidade concentração final 5 M NaCl 500 ml 2,5 M NaCl 1 M Tris-Cl pH 8 25 ml 50 mM Tris-Cl pH 8 0,5 M EDTA 5 ml 5 mM EDTA MilliQ-água 470 ml 1l volume final Mix NaCl, Tris, EDTA e água. Não DEPC tratar. Autoclave. 10 x PBS (tampão fosfato) pH 7,0 (volume total: 1l) Ingrediente volume / quantidade concentração final 5 M NaCl 260 ml 1,3 M NaCl 1 M Na 2 HPO 4 70 ml 70 mM Na 2 HPO 4 1 M NaH 2 PO 4 30 ml 30 mM NaH 2 PO 4 MilliQ-água 640 ml 1l volume final DEPC 1 ml 0,1% DEPC Mix NaCl, Na 2 HPO 4, NaH 2 PO 4 e água. Ajustar o pH para 7,0 com HCl pH. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave. 20x SSC pH 7,0 (volume total: 1l) Ingrediente volume / quantidade concentração final NaCl (58,44 g / mol) 175,32 g 3 M NaCl Na citrato (294,1 g / mol) 88,23 g 0,300 M citrato de sódio MilliQ-água até 1 l HCl dando pH 7,5 DEPC 1 ml 0,1% DEPC Dissolva NaCl e Na citrato em ~ 800 ml de água. Ajustar o pH para 7,0 com HCl pH. Ajuste o volume para 1 l com água. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave. 5 x TBE (volume: 1l) Ingrediente volume / quantidade concentração final Tris (121,14 g / mol) 54 g ~ 0,45 M Tris Ácido bórico (61,83 g / mol) 27,5 g ~ 0,45 M ácido bórico EDTA (372,24 g / mol) 3,7 g ~ 0,01 M EDTA MilliQ-água até 1l Mix Tris, ácido bórico, EDTA e água. O pH deve ser ~ 8.3. Diluir a 1 x TBE antes de usar. 10 x TE pH 8,0 (Tris EDTA, volume: 1l) Ingrediente volume / quantidade concentração final 1 M Tris-Cl, pH 8,0 100 ml 0,100 M Tris-Cl 0,5 M EDTA pH8.0 100 ml 0,050 M EDTA MilliQ-água até 1l Mix Tris, EDTA e água. Não DEPC tratar. Autoclave. NB! Tris não devem ser tratados com DEPC! Use RNase em pó e diluir com DEPC-treated/RNase-free MilliQ-água. 1 M Tris-HCl pH 7,5-9,5 (ml de volume 500) Ingrediente volume / quantidade concentração final Tris (121,14 g / mol) 60,57 g 1 M Tris MilliQ-água até 500 ml HCl dando pH 7,5 HCl dando pH 8,0 NaOH dando pH 9.5 Dissolver em Tris-DEPC água tratada. Ajustar ao pH desejado. Adaptar a um volume final de 500 ml. Autoclave. NB! Tris não devem ser tratados com DEPC! Use RNase em pó e diluir com DEPC-treated/RNase-free MilliQ-água. NB! Na clonagem molecular (veja acima), há uma tabela descrevendo quantos concentram HCl é necessária para atingir o pH correto. MATERIAL E MÉTODOS O protocolo em situ é apresentado acima e no filme. Informações adicionais aqui do material vegetal e sondas utilizadas neste exemplo específico são descritos. Material vegetal e delineamento experimental Cones masculinos de Picea abies [L.] Karst. (Noruega spruce) foram coletados em Uppsala, Suécia, Outono de 2007. Oito cones foram seccionados e as secções decada cone foram utilizados em cada tratamento. Três concentrações proteinase K foram testados, 1, 3 e 5 mg / mL e cada concentração foram tratados com ou sem RNase. Lâminas não tratadas com RNase foram deixados em PBS durante o tratamento RNase. Arabidopsis thaliana [L.] Heynh. e Brassica napus L., foram cultivadas sob condições controladas em uma câmara de cultura com 22 ° C/18 ° C dia / noite temperaturas e fotoperíodo de 16 h. Inflorescências jovens contendo botões florais, estágios 00-10 (estágios de acordo com Smyth 5) foram estudados. sondas cRNA RNA total foi isolado de P. abies cones masculinos, como descrito anteriormente e de 6 A. thaliana e B. napus usando Trizol (Gibco BRL, Frederick, Maryland, EUA) e da Qiagen RNeasy Usina Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), respectivamente, de acordo com as recomendações dos fabricantes. O cDNA foi sintetizado 0,5-1 mg RNA total, dependendo da espécie, utilizando Sobrescrito III Transcriptase Reversa (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) seguindo as instruções do fabricante. AtAP3 e BnAP3 sentido e fragmentos antisense e P. fragmentos de sentido abies foram isolados e amplificado utilizando primers gene específico (Tabela 1). DAL13 fragmentos antisense foram isolados e amplificado utilizando primers como na 7. A saliência T7 foi adicionado em fragmentos de A. thaliana e P. abies usando primers reverse modificado carregando a T7-seqüência (Tabela 1). A 500 ​​pb foi isolado utilizando BnAP3 primers específicos (Tabela 1) e clonadas em um vetor pGEM-T com um T7-promotor. Para o P. abies fragmentos todas as reações de PCR foram realizadas em um volume final de 20 l contendo 0,2 U Phusion Fidility alta DNA polimerase (Finnzymes, Espoo, Finlândia), 1x tampão Phusion HF, 200 mM de cada dNTP, 0,3 mM de cada primer e 25-50 ng de cDNA e um programa de PCR padrão foi usado com recozimento temperatura 60-55 ° C (touch-down -1 ° C / ciclo), seguido de 55 ° C. Sondas sentido e antisense cRNA para todas as três espécies foram sintetizados com transcrição in vitro utilizando a DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7; Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha), de acordo com as recomendações do fabricante e sondas de longa foram digeridos para cerca de 100-150 bp fragmentos usando um Na 2 CO 3 tampão de acordo com a 3. RESULTADOS Aqui no resultado seção descrevemos três diferentes exemplos de resultados típicos de experimentos in situ. O mecanismo genético que regula o desenvolvimento reprodutivo em gimnospermas e angiospermas por identidade de órgão especificando masculino e feminino parece ser evolutiva 09/07 conservada, apesar de que as duas linhagens de plantas de sementes separadas 285,000 mil anos atrás 10. Em A. thaliana os genes floral homeóticos APETALA3 (AP3 11) e pistillata (PI 12) são necessárias e suficientes para especificar o desenvolvimento reprodutivo do sexo masculino no contexto de uma flor, e esta função parece ser conservada dentro da linhagem das angiospermas 13. Em gimnospermas, o que falta flores e têm seus órgãos reprodutivos dispostos em separado cones masculinos e femininos (Fig. 1A-C), genes homólogos ao AP3 e PI são especificamente expressos nos órgãos levando o pólen do cone masculino, o microsporophylls 7,14. Assim, um conjunto semelhante de genes homólogos em ambos os angiospermas e gimnospermas define os órgãos de pólen de rolamento. Sondas genéticas específicas contra AtAP3 e BnAP3, respectivamente, deu sinais de fase 3 em jovens botões florais em uma região correspondente a whorl dois e três em A. thaliana e B. napus. Na tarde encenado buds os sinais eram restritos a pétalas de desenvolvimento e estames (Fig. 2A e B). Estes resultados estão de acordo com estudos anteriores 11,15,16. Sondas direcionados para o homólogo AP3 em P. abies, DAL13, produziu sinais no microsporophylls de P. abies cones masculinos, tanto antes como após o término meristema apical (Fig. 2C e D), como esperado a partir de estudos anteriores 7,14. Sondas sentido não deu sinal acima de fundo (Fig. 3A-B e os dados não mostrados). Em conjunto, estes resultados demonstram a expressão de A. AP3 thaliana e seus ortólogos em B. napus e P. abies no desenvolvimento de órgãos reprodutivos masculinos. Figura 1. A.thaliana e B. napus flores e pólen produzir cones masculinos da P. coníferas Imagens mostram abies inflorescências com botões florais e flores abertas de A.thaliana e B.napus em A e B, respectivamente. Note-se que as flores angiospermas além do perianth estéril portos de ambos os sexos órgãos reprodutivos; estames e carpelos. Mostrado na C é um ramo da gimnosperma P. abies com verde e vermelho agulhas vegetativo reprodutiva cones masculinos. Figura 2. Expressão de A. AP3 thaliana e genes homólogos em B. napus e P. abies. Micrografias mostram cortes longitudinais de A. thaliana e B. inflorescências napus em A e B, respectivamente, e P. abies cones masculinos em C e D. Seções hibridizado com sondas antisense contra AtAP3 em A e B BnAP3 em sinal de show em segundo e terceiro whorl órgãos florais. Números indica estágios florais de acordo com Smyth 5. Antisense sonda dirigida para o gene DAL13 deu sinal no microsporophylls levando pólen de P. abies cones masculinos, como mostrado no CD. Exemplos de microsporophylls são indicados por setas. Pontas de flecha no ponto AD para sinal de hibridação, que aparece como roxo. Em C e D compostos fenólicos dar cor acastanhada inespecífico para as células individuais da medula central. s, sepal; p, pétala; st, estame; c, carpelo; ms, microsporophyll; pi, medula; pp; pré-pólen células. Bar: 100 mm. Figura 3. DAL13 expressão em cones masculinos de P. abies. Todos os Micrografias (AH), estão mostrando secções longitudinais de cones masculinos após o término meristema apical. Setas apontam para tipos de células em que DAL13 é expressa. Seções em A e B são hibridizados com uma sonda controle dos sentidos para determinar coloração de fundo. Micrografias C a H são hibridizados com uma sonda antisense DAL13. Seções a partir de experimentos com e sem RNase tratamento são mostrados na D, F, H e C, E, G, respectivamente. Micrografias a partir de experimentos com 1 mg / ml proteinase K são mostrados em C e D, 3 mg / ml em E e F, e 5 mg / ml em G e H. Bar: 100 mm.