非放射性その場でハイブリダイゼーションプロトコール

in situハイブリダイゼーションのプロトコールでこの非放射性mRNAはノルウェートウヒの組織に最適化されており、詳細に説明されている。それは順番にマイヤーウィッツとアイルランドのラボからのプロトコルに基づいていると他の1から4の間でビビアンアイルランド、シンディリンカーンとジェフロングが最適化された私たちのグループで最適化されたin situハイブリダイゼーションのプロトコール、 シロイヌナズナ /菜種に基づいています。 PROCEDURE 1。固定と埋め込み RNAの保存の組織を提供するためには、 現場実験で実行される前にワックスに執着して埋め込 ​​む必要がある。不十分な固定材料は、mRNAが非常に豊富であるにもかかわらず、低いまたは検出不能なシグナルを与えるかもしれないので、固定と包埋は、重要なステップです。組織は、クリアと組織の損傷を避けるために、漸進的な変化のワックスに埋め込まれ、脱水です。さらに0.85パーセントNaClをノルウェートウヒ組織の脱水の最初のエタノールのステップに追加される細胞の収縮と腫れを防ぐことができます。エタノール中のNaClを（例えば、それがシロイヌナズナ/菜種プロトコルに取り残されている）省略することが可能です。埋め込み時の脱水工程は℃、最低でも+4でのRNase活性を保つために氷の上で実行することができるこのプロトコルでは4％パラホルムアルデヒド固定ソリューションでは、ことがあるが、それはおそらく何の違い（例えば、それがシロイヌナズナ/菜種プロトコルに取り残されている）行っていないことは議論にもかかわらず、優れたRNAの保持を与えることになっている0.25％のグルタルアルデヒドが、含まれています。ほとんどの場合、任意の標準的な固定や包埋のプロトコルを使用することができます。としてノルウェーのトウヒの埋め込みの下に見られるシロイヌナズナ/菜種プロトコルとは少し異なります。 1.1日1回収の植物材料とパラホルムアルデヒド固定興味の植物材料を収集し、必要に応じて詳細に分析します。直接またはできるだけ早く氷の上に組織を維持し、氷冷修正液の中に置いてください（下のレシピを参照）。NBは！氷の上にすべての時間をキープ！ パラホルムアルデヒドはバブルを開始するまでの試料に真空を適用する。最大3つの時間（例えば2シロイヌナズナと菜種の花の組織やノルウェートウヒ男性の円錐形のための1時間× 15分）までの真空を保​​持し、徐々に真空を解除してください。組織を固定液の減圧浸潤後にシンクするはずが、空気を多く含む特定の組織のためにそれは（例えば、シロイヌナズナの花）ことはできませんされています。ガーゼは、組織が固定液に滞在するために使用することができます。 ℃で一晩（〜12〜16時間）が静かに揺れ+4固定液とインキュベートを交換してください。 オプション1 NB！下記のノルウェートウヒの埋め込 ​​みバージョン（ステップ4-8）。シンチレーション管またはガラスバイアルは、少なくともステップ5で、使用されていることを確認してください。 1.2 2日目脱水NB！ノルウェートウヒの埋め込 ​​みバージョン。 0.85パーセントのNaCl 30分氷で 50パーセントエタノール+ 0.85パーセント塩化ナトリウム 90分氷で 70パーセントエタノール+ 0.85パーセント塩化ナトリウム 90分氷で ポーズ！数ヶ月間、4℃でここに停止し、70％エタノール+ 0.85パーセントNaClに組織を保存することが可能です。 85パーセントエタノール+ 0.85パーセント塩化ナトリウム 90分 +4 ° C 95パーセントエタノール（+エオシン） 90分 +4 ° C NB！エオシンは、それらを簡単に埋め込 ​​むとセクショニング時に検出することピンクの組織を染色するために追加されますが、除外されることがあります。 100パーセントエタノール（+エオシン） 90分 +4 ° C 100パーセントエタノール（+エオシン） 一晩 +4 ° C 1.3 3日目脱水と埋め込 ​​みNB！ノルウェートウヒの埋め込 ​​みバージョン。 <ol sタルト="10"> 100パーセントエタノール（+エオシン） 2時間 、室温 50パーセントエタノール+ 50％Histoclear II 1時間 、室温 100パーセントHistoclear II 1時間 、室温 100パーセントHistoclear II 1時間 、室温 50パーセントHistoclear II + 50％Histowax 一晩 40〜50 ° C NB！最後のステップでHistowaxの濃度は重要ではありません、ほんの一部のワックスチップに注ぐ。 1.4 4日目埋め込 ​​みNB！ノルウェートウヒの埋め込 ​​みバージョン。 100パーセント溶けたHistowax +60 ° C （朝と夕方の変更） 1.5 5日目埋め込 ​​みNB！ノルウェートウヒの埋め込 ​​みバージョン。 100パーセント溶けたHistowax +60 ° C （朝と夕方の変更） 1.6 6日目埋め込 ​​みNB！ノルウェートウヒの埋め込 ​​みバージョン。 100パーセント溶けたHistowax +60 ° C （朝と夕方の変更） NB！ワックスが時折一日一回変更された場合、それはOKですが、それは変化の一日を完了するために2日かかります。ワックスの変化にも問題がなく、2つの余分な日のために続けることができます。それはこれらの組織の中心にワックスの浸透を助けるので、これは大規模なサンプルをお勧めします。 オプション2 NB！以下シロイヌナズナ/菜種埋め込 ​​みバージョン（ステップ4-8）。 1.2 2日目脱水NB！シロイヌナズナ/菜種の埋め込 ​​みバージョン。 NB！他に記載されていない場合は4で全てのステップは、° Cと優しく、揺れ。 1X PBS 30分 1X PBS 30分 30％のエタノール 60分 40パーセントエタノール 60分 50パーセントエタノール 60分 60パーセントエタノール 60分 70パーセントエタノール 60分 ポーズ！ ℃で数ヶ月間+4ここに停止し、70％EtOH中で組織を保存することが可能です。 85パーセントエタノール 60分 95パーセントエタノール（+エオシン） 一晩 NB！エオシンは、それらを簡単に埋め込 ​​むとセクショニング時に検出することピンクの組織を染色するために追加されますが、除外されることがあります。 1.3 3日目脱水とembeddING NB！シロイヌナズナ/菜種の埋め込 ​​みバージョン。 NB！すべての室温でのステップではなく、他の場合優しく、揺れが記載されています。 100パーセントエタノール（+エオシン） 30分 100パーセントエタノール（+エオシン） 30分 100パーセントエタノール（+エオシン） 60分 100パーセントエタノール（+エオシン） 60分 NB！シンチレーションバイアルまたは他の（ガラス）バイアルに組織を移す。 75パーセントエタノール+ 25％Histoclear II 30分 50パーセントエタノール+ 50％Histoclear II 30分 25パーセントエタノール+ 75％Histoclear II 30分 100パーセントHistoclear II 60分 100パーセントHistoclear II 60分 100パーセントHistoclear II + ¼ボリュームHistowaxチップ一晩（無振り） NB！最後のステップでHistowaxの濃度は重要ではありません、ほんの一部のワックスチップに注ぐ。 1.4 4日目埋め込 ​​みNB！シロイヌナズナ/菜種の埋め込 ​​みバージョン。 ワックスチップが完全に溶融° Cまで、42時の組織とのバイアルを置きます。次のワックスチップの¼ボリュームを追加し、それらが完全に溶融しましょう​​。 +60 ° Cに移動し、数時間のためにバイアルを残す。最後に、60で一晩たて溶けたワックスとインキュベート℃でワックス/ Histoclear IIを交換してください 1.5 5日目埋め込 ​​みNB！シロイヌナズナ/菜種の埋め込 ​​みバージョン。 100パーセント溶けたHistowax +60 ° C （朝と夕方の変更） 1.6 6日目埋め込 ​​みNB！シロイヌナズナ/菜種の埋め込 ​​みバージョン。 100パーセント溶けたHistowax +60 ° C （朝と夕方の変更） NB！シロイヌナズナ/菜種プロトコルで（ノルウェートウヒプロトコルと比較して）一日5-6のと同じ方法で、7日目の埋め込 ​​みが存在する、つまり、100％溶けたHistowax 60℃、変更、朝と夕方 NB！ワックスが時折一日一回変更された場合、それはOKですが、それは変化の一日を完了するために2日かかります。ワックスの変化にも問題がなく、2つの余分な日のために続けることができます。それはこれらの組織の中心にワックスの浸透を助けるので、これは大規模なサンプルをお勧めします。 1.7第7日埋め込 ​​み（シロイヌナズナ/菜種プロトコルで8日目）（Film!技術的な詳細は映画の中で示されています ） +60℃で予熱したペトリ皿および/または金型ホットプレート（+60 ° C）をオンにして、溶けたHistowaxが利用可能であることを確認してください。 ホットプレート上に置かれたペトリ皿（または型）に組織や溶融Histowaxを注ぐ。組織がカバーされるように、より多くのHistowaxを追加。ピンセットを熱し、皿に均等にティッシュを配布。ペトリ皿を（または型）入力してください。組織が正しい位置になる前にワックスが固まる場合は、再度それを加熱したり、ピンセットの加熱ペアで硬化ワックスを取り除く。 4でそれを置く前に室温でワックスブロック硬化レット℃にきつくピースがセクショニング時に切り出されているときにワックスのブロックが割れる可能性があるため、組織を埋め込む代わりに、いくつかのワックスのブロックをするのが良いです。 ポーズ！ 4＆で保存度、C.組織は何年も安定しています。 NB！このステップと以降はRNaseフリーの仕事。手袋を使用して、ミリQ水、バッファ、ガラス製品など、オートクレーブバッファと焼くガラス製品などの際に適切なDEPC -扱います。 2。 （Film!技術的な詳細は映画の中で示されている ）セクショニングつのホットプレートの電源をオン（+60℃および+42 ° C）と溶融Histowaxが利用可能であることを確認してください。 メスを熱し、慎重にペトリ皿（一つがあまりにも暴力的であればそれは割れるかもしれない）から組織のワックスのブロックを切り出し、または金型から取り出します。単一のワックスのブロックが分離されている場合は、ミクロトームでスライスを容易にするために適切なサイズと形にピースを形作る。 ワックスピースは、それがブロックホルダーに取り付けることができるように組織の下に余分なワックス"ヒール"を持つべきです。ホットプレート（+60 ° C）で、ブロックホルダーとかかとを加熱し、それらを融合させる。それは、融合を安定させるためにHistowax IIのドロップを置くために必要になる場合があります。それ+4硬化℃にしましょうミクロトームを使用して、長いリボンで接続さ6〜8μm厚の部分にワックスブロックをカット。 NB！これは、ワックスのブロックが冷えている場合、すなわち° Cは+4でワックスのブロックを格納し、切削を開始するときに冷蔵庫から持ってきやすくなります。また、ナイフの寒さを保つために有益なことができます。 虫眼鏡でセクションのリボンを勉強して使用するものをマーク。 （プローブオンプラスプリ洗浄と充電されているフィッシャーバイオテクノロジー、から）スライドにRNaseフリーミリQ水を入れてください。小さな部分にリボンをカットし、スライド上に（下​​に"戻る"または"光沢"側）に置く。リボン付きのスライドが42℃のプレート上に配置する必要があります。リボンは、水で（これは重要です！）平らにしてください。の項では、数分間座ってから水のドレインにキムワイプ/ティッシュペーパーを使用してみましょう。 1〜2時間のためのプレート上にスライドしておきます。 組織は、スライドに付着℃で一晩ように42でスライドをインキュベートする。 ポーズ！それはできるだけ早くセクションを使用することをお勧めしますが、それらは4で、いくつかの日まで乾燥剤℃で密閉箱に乾燥保存することができます。 3。プローブメイキング in situハイブリダイゼーションで特定のmRNAの標識プローブの特定を使用して式を検出します。最も頻繁に相補的なRNAの一部であるプローブは、ジゴキシゲニン、DIGでタグ付けすることができます。 DIGはウリジンに接続されていると、それによってRNAプローブに組み込まれているし、DIG特異的抗体を用いて検出することができる小分子、です。 プローブの設計と作成は、in situハイブリダイゼーション実験で RNAの最も重要なステップです。ケアは、プローブは高い特異性を持ち、高品質のUTPsで標識されていることを確認する注意が必要です。時にはハイブリダイゼーション温度および/または反応の長さは、特定のプローブに調整する必要があります。いつものように、RNaseのコンタミを避けるために注意すべきである。 ラベリングの前に、あなたの標準的なプロトコルに従ってテンプレートを分離する、などのcDNAクローン、PCR -断片を、使用してテンプレートを線形化する。センス及びアンチセンスフラグメントを単離し、遺伝子特異的プライマーを使用して、テンプレートから増幅されています。 PCR用増幅された断片は3'突出末端を生成する酵素を使用しないでください。すべてのフラグメントにT7（またはSP6またはT3）オーバーハングは、T7 -シーケンスを伝送中であるか、またはT7 -プロモーターを有するベクターを使用して、プライマーを使用して追加されます。 センス（mRNAまたは（ – ）鎖）アンチセンス（抗mRNAまたは（+）鎖）プローブがハイブリダイズするため、相補的な配列を持っているとしながらプローブは、標的mRNAと同じ配列を持ち、標的mRNAにハイブリダイズしません目的の信号を与えるターゲット。センスプローブは、ネガティブコントロールとして使用され、実験が適切に働いていた場合はシグナルは得られないでしょう。ポジティブコントロールは、ハウスキーピング遺伝子を検出するプローブを、例えば、必要とされる。唯一のいくつかのスライドを別のコントロールプローブにハイブリダイズする必要がある一方スライドの大半は、アンチセンスプローブとハイブリダイズしてください。 in vitro転写で使用して3.1プローブのラベリング DIG RNAラベリングキット（SP6/T7、11175025910、ロシュダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ）から試薬プローブを標識する際または同様のを使用しています。ここで説明する20μlの反応は、DIGラベルされたRNAの〜10μgをもたらす必要があります。 in vitro転写されたヌクレオチドを組み込むことができます。チューブ（氷上で維持する）に以下の試薬を追加します。 成分ボリューム/金額 10 × NTPラベリング混合液 2μlの 10 ×転写バッファー 2μlのプロテクターRNaseインヒビター 1μL（20U） RNA T7ポリメラーゼ（SP6またはT3） 2μlのテンプレートDNA（500から1000 NG） Xμlを RNaseフリーミリQ水 18μlの最終容量にyの添加、 NTPの標識混合、転写バッファー、RNase阻害剤（NB!プローブが短い場合、例えば<500bp、あなたが40UにRNase阻害剤の濃度を高める可能性があります）、ポリメラーゼ、テンプレートDNAと水を混合し、その後スピンダウンする。 37で反応ミックスをインキュベート℃で2時間（NB!プローブが短い場合、例えば<500bp、4〜6時間の反応時間を増加させる ）。 15分間+372μlのDNase Iとインキュベート° Cを追加。 2μlの0.2 M EDTA（pH 8.0）を加え、反応を停止させます。ゲル上で製品をチェックしてください。 4 M LiClと> 99.5％エタノール75μlの2.5μlを添加してプローブを沈殿させる。よく混和して、（NB!がキャリアとしてtRNAを使用しないでください。代わりにメーカーによるとグリコーゲンまたはアクリルアミドを使用する ）-20℃で一晩インキュベートする。 4℃で30分間、遠心分離（13,000 rpm）で° C、上清を取り除く。 70％エタノールでペレット（少なくとも10分13,000回転）を2回（〜150〜300μl）を洗浄する。 上清を除去し、ペレット乾燥をしましょう​​。氷上で1〜2時間、30μlのRNaseフリー水でプローブを再懸濁します。 ポーズ！プローブは一年以上は-20℃で保存することができます。 NB！ステップ27（プローブがされている時から、ステップ21（in vitro転写前）、ステップ23（DNase処理前）、ステップ24から（DNase処理後、降水前）0.5μlのサンプルを保存し、1μlのサンプル）再懸濁した。 nondenaturating 1％TBEゲル上でサンプルを実行します。のDNase反応が正常に動作していた場合、テンプレートベースバンドが消えます。 in vitro転写約正しいサイズの厚さのRNAのバンドを生成する必要があります。あなたが複数のバンドが表示された場合、ロード前に氷上で急冷、続いて5分間80℃でサンプルをdenaturate。ステップ27からの回復が悪いようなら、プローブがよく再懸濁されていないので、それはそうかもしれない。 ° C 5〜10分が溶液中にそれを得るために55でRNAをインキュベートする。 長いプローブ3.2加水分解 NB！あなたのプローブは150 bpより大きい場合、それはより良い浸透に起因する高い信号を、与えるために50〜150 bpに引き下げられるべきである。プローブは、炭酸塩緩衝液（pH 10.2）で化学的に低下する場合があります。プローブが正しいサイズである場合の加水分解工程を省略していますが、プローブに一冊のホルムアミド、すなわち30μlを、追加してください。 0.2 M炭酸水素ナトリウム（NaHCO 3水溶液 ）と0.2 Mの炭酸ナトリウム（Na 2 CO 3の ） を準備します。どちらも、新鮮でなければなりません。 5ミリリットルH 2 O、2 mlの0.2 M 炭酸水素ナトリウムおよび3mLの0.2MのNa 2 CO 3を混合して 2つのバッファをテストします。 pHは〜10.2である必要があります。 インキュベーション時間を計算します。 インキュベーション時間（分単位）=（L 0 – L F）/（K * L 0 * L F） （KB単位）プローブのL 0 =開始長さ L KB =例：0.100キロバイトのプローブの f =最終的な長さ K = 0.11 KB – 1分- 1加水分解のための=速度定数あなたのプローブの半分を加水分解し、残りは後に取っておく。 RNaseフリー水で50μlにプローブを希釈し、20μlの0.2 M NaHCO 3の （最初の追加）と30μlの0.2 MのNa 2 CO 3を加える。ミックスと計算されたインキュベーション時間を60℃でインキュベートする。 1 M NaOAc pHが4.7の10μlを加え、反応を停止させます。 10μlの4 M LiClを2と300μlのエタノを追加することによってプローブを沈殿させるL（ 必要に応じてキャリアとしてNB!使用グリコーゲンまたはアクリルアミド、）。一晩-20℃でインキュベートする。 4℃で30分間、遠心分離（13,000 rpm）で° C、上清を取り除く。 70％エタノールでペレットを2回（〜300μl）を洗浄する。遠心（13,000 rpm）を4で各洗浄において少なくとも℃で10分上清を除去し、ペレット乾燥をしましょう​​。 30μlのRNaseフリーミリQ水でプローブを再懸濁します。プローブに一冊のホルムアミド、すなわち30μlのを、追加。 ポーズ！プローブは一年以上は-20℃で保存することができます。 NB！加水分解プローブ2μlのと加水分解プローブ2μlを（ホルムアミドを添加する前に）取るとnondenaturating 1％TBEゲル上で確認してください。 2つのサンプル間の大きさに違いがあるはずです。プローブは、負荷の前に氷上で急冷続いて5分間80℃で変性することが必要な場合があります。 （4）in situハイブリダイゼーション（Film!技術的な詳細は、映画の中で示されています ） すべてのソリューションはRNaseフリーであることを確認してください！それは、DEPC -御馳走すべてをする必要はありませんが、ミリQ水に少なくともオートクレーブを使用してください。すべてのガラス器具は5時間℃で一晩または少なくとも200℃に加熱されていることを確認します。プラスチック容器を扱い、一晩攪拌しながら0.1 M NaOHを用いて棒をかき混ぜる。オートクレーブ滅菌ミリQ水（〜500ミリリットル/コンテナ）を有するプラスチック容器を数回すすいでください。それは、ハイブリダイゼーションを乱す可能性のNaOHの痕跡を避けるために慎重に容器をリンスすることが重要です。トリス緩衝液を除き、すべてのストック溶液をDEPC -扱います。すべてが利用可能であることを保証するために実験を開始する前にすべてのソリューションなどを確認してください。ステップ61（ステップ51から52を除く）まで、我々は簡単にコンテナ間で移動されたラックにスライドしてください。 その場の項の前処理4.1 セクションを脱水/脱パラフィン： 2倍の10分Histoclear II（ガラス容器を使用） 2 × 1〜2分100％EtOHを 1〜2分95％エタノール 1〜2分90％EtOHを 1〜2分80％EtOHを 1〜2分60％EtOHを 1〜2分30％EtOHを 1〜2分、H 2 O 室温で2 × SSCで15〜20分のためのスライドを洗う（NB!は、インキュベーション時間の間にステップ42で使用されるホルムアルデヒドを準備 ）。 +37プロテイナーゼKで30 minで穏やかに振とうさせながらC（例えば、1シロイヌナズナ/菜種およびノルウェートウヒは3μg/ mlの用μg/ ml）のための組織を扱います。 37にミックスし、予熱℃〜100 mMトリスpHを8及び50mMのEDTA。すぐにスライドを治療する前に、プロテイナーゼKを追加します。NB！プロテイナーゼK処理は、組織、植物種や年齢に応じて最適化する必要があります。 （NB!は、インキュベーション時間の間にステップ45で使用されるトリエタノールアミンを準備します ）。 室温で1 × PBSで2mg/mlグリシンと2分間スライドを扱います。 （NB!はグリシンが適切に溶解されていることを確認するためにそれを使用する前に、一日PBSでグリシンを混ぜる ）。 室温で1 × PBSで2分間、スライドを洗浄する。 室温で1 × PBSで2分間、スライドを洗浄する。 室温で1 × PBSのpH 7の4％（w / v）のパラホルムアルデヒド（新鮮製）で10分間スライドをインキュベートする。ガラス容器を使用してください。 室温で1 × PBSで5分間、スライドを洗浄する。 室温で1 × PBSで5分間、スライドを洗浄する。 （ステップ45の溶液中に無水酢酸を分注する）。 0.1Mトリエタノールアミン（作られた新鮮な、pHを8）と室温で無水酢酸で10分間スライドをインキュベートする。 室温で1 × PBSで5分間、スライドを洗浄する。 室温で1 × PBSで5分間、スライドを洗浄する。 脱水： 30秒30パーセントエタノール 30秒60パーセントエタノール 30秒間80％のエタノール 30秒90パーセントエタノール 30秒95％エタノール 2 × 30秒、100％エタノール ポーズ！それは、℃で数時間+4ここに停止して底部にエタノールを少量容器でスライドを保存することが可能です。 in situハイブリダイゼーション4.2（Film!技術的な詳細は映画の中で示されています ） どのプローブで使用するスライドを決定、センスおよびアンチセンスプローブだけでなく、ポジティブコントロールの両方を使用することを忘れないでください。 （NB! ProbeOnプラスフィッシャーバイオテクノロジーからのスライドは、それらのプロトコルのハイブリダイゼーション/検出ステップ中にペアに挟まことを可能にする白い霜を持っている。）同じ濃度で同じプローブが特定のスライドのペアで使用してください。スライドのペアの合計数に基づいて作成する方法をはるかにハイブリダイゼーション溶液を決定します。予熱+60℃におけるデキストラン硫酸ハイブリダイゼーション溶液は、デキストラン硫酸から非常に粘性である。 60でのハイブリダイゼーション溶液を入れ℃、それは扱いが容易になります。プローブが適用される前にきれいな紙タオルまたはキムワイプ/ティッシュペーパー上でスライドを風乾します。スライドが完全に乾燥している必要があります。スライドのペアごとにプローブを追加します。実際の実験は、予備成形される前に、最適濃度を見つけるために、異なるプローブの濃度（例えば0.5、2、4μl）をテストすることが重要です。 ハイブリダイゼーション溶液 5スライドのペア 10スライドのペア 15スライドのペア 20スライドのペア その場で塩で 10倍 100μlの 200μlの 300μlの 400μlの脱イオン化ホルムアミド 400μlの 800μlの 1200μL 1600μL 50パーセントデキストラン硫酸（+60 ° C） 200μlの 400μlの 600μlの 800μlの 50倍デンハルト溶液 20μlの 40μlの 60μlの 80μlの tRNAは（100mg/ml） 10μlの 20μlの 30μlの 40μlの H 2 O（DEPC処理） 70μlの 140μL 210μL 280μL 合計ボリューム 800μlの 1600μL 2400μL 3200μL 20μlの最終容量にRNaseフリーミリQ水でプローブを希釈する。 40μlの合計体積を与えるプローブに複数のボリューム（すなわち、20μlの）ホルムアミドを追加。 80にプローブを加熱℃で2分間。 2分間氷上に置きます。スピンダウン。氷の上でプローブを保持します。このプローブ混合物は、スライドの一組で十分です。特定のプローブのためのスライドのペアの合計数に従って掛けます。 各スライドのペアのために200μlの最終容量を与えるスライドの各ペアのためのハイブリダイゼーション溶液の160μlを（すなわち160μlをハイブリダイゼーション溶液+40μlのプローブ）を追加します。気泡を生成せずに混ぜる。 1枚のスライドにプローブを適用すると徐々に一緒に2つのスライドを融合する。 （NB!挟むだけプローブオンプラススライド、または同等のスライドで行うことができます。曇らすことなく、スライドをカバースリップの代わりに挟んで使用する使用されている場合。） プラスチック製のピペットを用いてプラスチック製容器（シールきつく）にぬれたペーパータオル上にスライドを上昇させる。ハイブリダイズする50〜55℃で一晩（12〜16時間）。 その場のポストハイブリダイゼーションでは4.3（Film!技術的な詳細は映画の中で示されています ） 温暖化により in situポストハイブリダイゼーションの準備〜2 L 0.2 × SSC（+55 ° C）と〜2 L 1 × NTE（+37℃）で一晩。 RNase処理（以下の手順57から59）が実行されている場合、より多くのSSCとNTEが必要です。 それらを分離し、洗浄する暖かい0.2 × SSC（上記参照）に、各スライドのペアを浸します。そのコンテナ内にラックに配置します温かい0.2 × SSCで。 55で穏やかに撹拌しながら0.2 × SSCで60分間、スライドを洗浄℃に（NB!は、インキュベーション時間の間にステップ63で使用されているベーリンガーブロックの溶液を調製します。） 60分間0.2 × SSCで洗浄を繰り返します。 （RNaseのステップは60ステップに続行できない場合、このインキュベーション中にRNaseの雪解けを聞かせ実行される場合NB!。） オプション：37で暖かい1X NTEで5分（上記参照）のためにスライドを洗浄° C穏やかに振とうさせながら。 オプショナル：+37で5分間のウォーム1X NTEで洗浄を繰り返し° Cを穏やかagtationで。 オプション：37℃で30分間穏やかに撹拌しながらCのRNase（20μgの/ 1X NTEのMLアーゼ）でスライドを扱う。その後37で1XのNTEで5分間洗浄℃で穏やかに撹拌しながら。 1X NTEの洗浄を繰り返します。 ° C穏やかに撹拌しながら55で0.2 × SSCで60分間スライドを洗浄する。 （NB!は、インキュベーション時間の間にステップ64から65と67で使用されているブロックの溶液を調製します。） 室温で1 × PBSで5分間スライドを洗う（Pause!あなたが次の日に続行するか℃で一晩場合+4 1XPBSでスライドが格納されることがあります。） 試料面を上に大規模なプラスチック容器の底部にスライドを置きます。 穏やかに撹拌しながら室温で45分間、100mMのトリスpH7.5、150mMのNaClの1％ベーリンガーブロックを使用してスライドをインキュベートする。ちょうどブロッキング溶液を使用してスライドをカバー。スライドはまだプラスチック容器内にあるか、新しいコンテナにスライドを配置しながらブロッキング溶液を捨て。ソリューションをオフに注ぐときにスライドは、通常、プラスチック容器に付着するが、それらが容器から脱落しないようにしてください。 100mMのトリスpH7.5、150mMのNaCl、0.3％トリトンX – 100で1.0％のBSAとベーリンガーブロックのソリューションを交換してください。ステップ63のようにインキュベーションを行います。 ステップ64からBSA /トリス/食塩/トリトン溶液中で抗DIG抗体を（10ミリリットルBSAで1:1250、すなわち8μlの抗体）希釈する。プラスチック製計量皿の抗体溶液の水溜りを確認。サンドイッチは、毛管力は、ソリューションをプルできるように一緒にスライドします。キムワイプ/ティッシュペーパーを排出し、気泡を回避しようと、繰り返す。 プラスチック容器のウェットペーパータオルの上にスライドを高めるとスライドが2時間室温で座ることができます。 キムワイプ/ティッシュペーパーとは別のスライドをドレイン。ステップ63のようにプラスチック容器の底に置きます。 BSA /トリス/食塩/トリトンソリューションの4倍洗う。各15分の時間、室温で穏やかに攪拌。 10分100mMのトリスpH 9.5、100mMのNaCl、50mMのMgCl 2の 。ステップ63のようにプラスチック容器の底に置きます。 洗剤のすべてを確実にするためにトリスpH 9.5/NaCl/MgCl 2溶液にディップスライドが洗い流されている。 サンドイッチを作る、65のように欧米の青色溶液を描く。一回繰り返します。 場所は、室温で1-5日のために完全な暗闇での湿紙タオル（スズ箔で覆い）上記のプラスチック容器にスライドします。毎日1回、6、12および24時間後に確認してください。 ドレインのスライドは、反応を停止する1xTEですすいでください。スライドを顕微鏡で検査される前に、カバースリップを置きなさい。スライドは数ヶ月のために1 × TEに保存されますが、できるだけ早く写真を撮ることができます。 レシピ/ストック溶液 NB！できる限り、例えば、DEPC -治療ミリQ水（オートクレーブ（15 psiで20分、すなわち液体のサイクルで1.05キロ/ cm 2とは 、）。一夜にしておきます。0.1％DEPCを追加で使用するなどのようにRNaseフリーミリQ水を使用して、少なくともオートクレーブミリQ水。バッファーとストック溶液を調製する際には、代わりにバッファーとストック溶液そのものをDEPC -処理するのDEPC処理水でRNaseフリーの塩等を溶解することも可能です。あなたがDEPC -御馳走水をしない場合、バッファと株式ソリューション、少なくともオートクレーブまたはそれらを滅菌フィルター。 ポーズ！室温でストアバッファと株式のソリューションは、他に述べられている場合ではない。 NB！あなたは、バッファと同様に分子クローニングにそれらを作るためのヒント（サンブルック、J.、およびDWラッセル、2001年の多くを見つけることができます。モレキュラークローニングアラボラトリーマニュアル3編、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、米国）。 0.1Mトリエタノールアミンの無水酢酸（pHを8、容積：800 ml）を。 成分ボリューム/金額最終濃度トリエタノールアミン 10.4ミリリットル 0.1 MトリエタノールアミンミリQ水 786.4ミリリットル最終容量800ミリリットル塩酸 3.2ミリリットル pHを与える8.0 無水酢酸 4.8ミリリットル 0.6パーセント 0.1 Mトリエタノールアミン緩衝液（pH8.0）を作るために、H 2 Oの786.4ミリリットルのトリエタノールアミン10.4 mlを希釈し、8.0（pH指示薬に確認してください）にpHをもたらすために塩酸3.2 mlを加える。 壊れた10 mlのプラスチックのピペットや底の攪拌バーとトリエタノールアミンのコンテナに似て、スライドラックを高める。 数分それがよく混合されるようにスライドを入れる前に、トリエタノールアミンに4.8ミリリットルの無水酢酸を分注する。 NB！ 0.1Mトリエタノールアミン新鮮を作成し、ちょうどインキュベーションの前に無水酢酸を加える。 NB！ガラス容器を使用してください。無水酢酸は水に不安定であるため、トリエタノールアミンバッファーを使用する必要があります。 1 × TBE中のアガロース（1％）ゲル（容積：100 ml）を成分ボリューム/金額最終濃度アガロース 1グラム一パーセント 1 × TBE 最大100 mlまで 1 × TBEでミックスアガロース。熱/沸騰アガロースが溶けるまで。ゲルをキャスト。 1 × TBEバッファーでゲルを実行します。 硫酸デキストラン DEPC処理ミリQ水（すなわち、50％（w / v）の）と5グラムデキストラン硫酸10 mLまで希釈し、60℃で溶解する ポーズ！ -20℃で保存 0.5 M EDTA pH8.0（titriplex III、容積500 ml）を成分ボリューム/金額最終濃度 EDTA（372.24グラム/モル） 93.06グラム 0.5 M EDTA ミリQ水最大500 mlに NaOHで 〜10 gのペレット pHが8.0を与え DEPC 0.5ミリリットル 0.1％DEPC 水（pH8.0で起こる）にEDTAを溶解、500mlの最終容量に調整する。 0.1％DEPCを追加。一晩おきます。オートクレーブ。 解決策/固定液（ステップ1〜3、42）修正 – 4％（w / v）の1X PBS、pH 7.0の（650 ml）中のホルムアルデヒド成分ボリューム/金額最終濃度ミリQ水 585ミリリットル 10倍PBS 65ミリリットル 1X PBS 10M水酸化ナトリウム 520μL 与えるpHが〜11 パラホルムアルデヒド 26グラム 4パーセント濃塩酸 449μL 与えてpHを〜7 ミックス水、PBSおよびNaOHおよび60から70への熱° C（温度、高pH、それが簡単にパラホルムアルデヒドを溶解するようになります。 （ドラフト内で）パラホルムアルデヒドを追加。 解決策がクリアされたときに氷の上に置いて、449μlの濃塩酸を加えることによってpHを7.0に調整する。 NB！新鮮ください。 NB！トウヒのプロトコルのグルタルアルデヒドで0.25％、650ミリリットル、1000 mlの全体積に10ミリリットルの25％グルタルアルデヒドの合計量に対して、すなわち6.5ミリリットルの25％グルタルアルデヒドの最終濃度に添加した（同じで水を減らすために覚えているボリューム）。 NB！ pHを調整した後、手順1〜3で固定を容易にするために表面張力を減らすために、ツイーン20および/ ​​またはトリトンX – 100、数滴を追加します。ステップ42では使用しないでください！ NB！植物組織を固定する場合より小さいボリューム（例：100〜200ミリリットル）固定液は、一般的に必要とされる。 その場で塩（容積100mL） 中の 10倍成分ボリューム/金額最終濃度 5 M NaClを 60ミリリットル 3M NaClを 1 Mトリス- Cl pH8.0の 10ミリリットル 0.100 Mトリス 1 Mリン酸ナトリウムpH6.8で 10ミリリットル 0.100 Mリン酸ナトリウム 0.5 M EDTA 10ミリリットル 0.050 M EDTA ミリQ水最大100 mlまで pHを6.8（46.3ミリリットルの1 M Na 2 HPO 4 + 53.7ミリリットル1 MのNaH 2 PO 4）でのNaリン酸緩衝液を混ぜる。ミックスのNaCl、トリス、リン酸ナトリウム緩衝液、EDTAと水。オートクレーブ。 ポーズ！ -20℃で保存 4 M LiClを2（塩化リチウム、容積：100 ml）を成分ボリューム/金額最終濃度塩化リチウム2（42.39グラム/モル） 16.956グラム 4M塩化リチウム2 ミリQ水最大100 mlまで DEPC 0.1ミリリットル 0.1％DEPC 水に塩化リチウム2を溶かし、100mlの最終容量に調整する。 0.1％DEPCを追加。一晩おきます。オートクレーブ。 ポーズ！ 4℃で保存する 1 MのMgCl 2 · H 2 O（塩化マグネシウム、容積：100 ml）を成分ボリューム/金額最終濃度のMgCl 2 · H 2 O（203.30グラム/モル） 20.33グラム 1 MのMgCl 2 · H 2 O ミリQ水最大100 mlまで DEPC 0.1ミリリットル 0.1％DEPC 水に塩化マグネシウムを溶解、100mlの最終容量に調整する。 0.1％DEPCを追加。一晩おきます。オートクレーブ。 NB！ MgCl 2のは非常に吸湿性である。長時間開いたボトルを保管しないでください。 の5M NaCl（塩化ナトリウム、容積：1リットル） 成分ボリューム/金額最終濃度塩化ナトリウム（58.44グラム/モル） 292.2グラム 5 M NaClをミリQ水最大1リットルまで DEPC 1ミリリットル 0.1％DEPC 1リットルの最終容量に調整し、水に食塩を溶かす0.1％DEPCを追加。一晩おきます。オートクレーブ。 1 M NaOAc pHを4.7（酢酸ナトリウム、容積：100 ml）を成分ボリューム/金額最終濃度 NaOAc（82.03グラム/モル） 0.8203グラム 1 M NaOAc ミリQ水最大100 mlまで酢酸 pHが4.7を与え DEPC 0.1ミリリットル 0.1％DEPC 水のNaOAcを溶かす。 4.7にpHを調整する。 100mlの最終容量に調整します。 0.1％DEPCを追加。一晩おきます。オートクレーブ。 0.2 MのNa 2 CO 3 pH11.4（炭酸ナトリウム、体積：10 ml）を成分ボリューム/金額最終濃度のNa 2 CO 3 </suB> 0.21198グラム 0.2 MのNa 2 CO 3でpH = 11.4 ミリQ水最大10 mlに水のNa 2 CO 3を溶解する、10 mlの最終容積に調節。 pHは11.4になります。 NB！新鮮ください。 0.2 M NaHCO 3を pH8.2（重炭酸ナトリウム、体積：10 ml）を成分ボリューム/金額最終濃度 NaHCO 3の 0.16802グラム 0.2 M NaHCO 3水溶液 ：pH値= 8.2 ミリQ水最大10 mlに水に飽和NaHCO 3を溶かし、10 mlの最終容積に調節。 pHは8.2でなければなりません。 NB！新鮮ください。 の1 M Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O（容積500ml）に成分ボリューム/金額最終濃度のNa 2 HPO 4 · 2 H 2 O（177.99グラム/モル） 88.995グラムの1 M Na 2 HPO 4 ミリQ水最大500 mlに DEPC 0.5ミリリットル 0.1％DEPC 水のNa 2 HPO 4を溶解、500mlの最終容量に調整する。 0.1％DEPCを追加。一晩おきます。オートクレーブ。 1 MのNaH 2 PO 4 · H 2 O（容積500ml）に成分ボリューム/金額最終濃度のNaH 2 PO 4 · H 2 O（137.99グラム/モル） 68.995グラム 1 MのNaH 2 PO 4 ミリQ水最大500 mlに DEPC 0.5ミリリットル 0.1％DEPC 2 NaHを水のPO 4を溶解、500mlの最終容量に調整する。 0.1％DEPCを追加。一晩おきます。オートクレーブ。 5倍NTE（総容積：1L） 成分ボリューム/金額最終濃度 5 M NaClを 500ミリリットル 2.5 M NaClを 1 Mトリス- Cl pHを8 25ミリリットル 50mMのトリス- ClのpHを8 0.5 M EDTA 5ミリリットル 5mMのEDTA ミリQ水 470ミリリットル最終的な音量1リットルミックスのNaCl、トリス、EDTAと水。 DEPC -御馳走しないでください。オートクレーブ。 10 × PBS（リン酸緩衝生理食塩水）pH 7.0の（総容積：1L） 成分ボリューム/金額最終濃度 5 M NaClを 260ミリリットル 1.3 M NaClをの1 M Na 2 HPO 4 70ミリリットル 70㎜のNa 2 HPO 4 1 MのNaH 2 PO 4 30ミリリットル 30mMののNaH 2 PO 4 ミリQ水 640ミリリットル最終的な音量1リットル DEPC 1ミリリットル 0.1％DEPC ミックスのNaClをNa 2 HPO 4、のNaH 2 PO 4と水。 HClでpH 7.0にpHを調整する。 0.1％DEPCを追加。一晩おきます。オートクレーブ。 20 × SSC pHは7.0（総容積：1L） 成分ボリューム/金額最終濃度塩化ナトリウム（58.44グラム/モル） 175.32グラム 3 M NaClをナトリウムクエン酸（294.1グラム/モル） 88.23グラム 0.300 MのNaクエン酸ミリQ水最大1 lに塩酸 pHが7.5を与え DEPC 1ミリリットル 0.1％DEPC 〜800 mlの水に食塩とナトリウムクエン酸を溶かす。 HClでpH 7.0にpHを調整する。水で1Lに音量を調整します。 0.1％DEPCを追加。一晩おきます。オートクレーブ。 5 × TBE（容積：1L） 成分ボリューム/金額最終濃度トリス（121.14グラム/モル） 54グラム 〜0.45 Mトリスホウ酸（61.83グラム/モル） 27.5グラム 〜0.45 Mホウ酸 EDTA（372.24グラム/モル） 3.7グラム 〜0.01 M EDTA ミリQ水最大1リットルまでミックストリス、ホウ酸、EDTAと水。 pHは〜8.3でなければなりません。使用前に1 × TBEに希釈する。 10 × TE pHが8.0（トリスEDTA、容積：1L） 成分ボリューム/金額最終濃度 1 Mトリス- Cl、pH8.0の 100ミリリットル 0.100 Mのトリス- Cl 0.5 M EDTA pH8.0 100ミリリットル 0.050 M EDTA ミリQ水最大1リットルまでトリス、EDTAと水を混ぜる。 DEPC -御馳走しないでください。オートクレーブ。 NB！トリスは、DEPC処理すべきではない！ RNaseフリーのパウダーを使用しDEPC-treated/RNase-freeミリQ水で希釈する。 1 MのTris – HCl pHが7.5から9.5（容積500ml）に成分ボリューム/金額最終濃度トリス（121.14グラム/モル） 60.57グラム 1 MトリスミリQ水最大500 mlに塩酸 pHが7.5を与え塩酸 pHが8.0を与え NaOHで pHが9.5を与え DEPC処理水にTrisを溶解する。所望のpHに調整してください。 500mlの最終容量に調整します。オートクレーブ。 NB！トリスは、DEPC処理すべきではない！ RNaseフリーのパウダーを使用しDEPC-treated/RNase-freeミリQ水で希釈する。 NB！モレキュラークローニング（上記参照）で、正しいpHを達成するために必要とされるどの程度の塩酸を集中記述するテーブルがあります。 材料および方法 その場プロトコルの上に、映画の中で提示されます。この特定の例で使用される植物材料とプローブのここで追加情報が記載されている。 植物材料と実験計画 ドイツトウヒ男性コーン[L.]カルスト。 （ノルウェートウヒ）ウプサラ、スウェーデン、2007年秋に採取された。八コーンから切片およびセクションいました各円錐は、それぞれの治療に使用されていました。三プロテイナーゼKの濃度が試験された、1、3、5μg/μLの各濃度は、RNaseの有無に関係なく処理した。 RNaseで処理していないスライドは、RNase処理中に、PBSに残された。 シロイヌナズナは、[L.] Heynh。とセイヨウアブラナ L.は、22の培養チャンバーで制御された条件下で増殖させたC/18 ° C昼/夜の気温と16時間の日長花芽を含む若い花序は、ステージ00から10は（ステージがスミス5に従って）検討した。 cRNAプローブ トータルRNAは、Pから単離された前述の6とし、Aからのモミ属の雄コーンシロイヌナズナとB.メーカーの勧告に従って、それぞれ、TRIZOL（ギブコBRL、フレデリック、メリーランド州、米国）とキアゲンしたRNeasy植物ミニキット（キアゲン社、ヒルデン、ドイツ）を使用してセイヨウ 。 cDNAは、製造元の指示に従って、上付きIII逆転写酵素（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）を用いて、種に応じて、0.5〜1μgのトータルRNAから合成した。AtAP3とBnAP3センスおよびアンチセンスフラグメントは、とP.トドマツセンスフラグメントを単離し、。DAL13アンチセンスフラグメントを単離し、7のようにプライマーを用いて増幅された遺伝子特異的プライマー（表1）を用いて増幅した。 T7のオーバーハングは、Aからのフラグメントに追加されましたシロイヌナズナとP. T7 -シーケンス（表1）を運ぶ変更リバースプライマーを用いてモミ属 。 500 bpの断片がBnAP3特異的プライマーを（表1）を使用して単離され、T7 -プロモーターをpGEM – Tベクターにクローニングした。 P.トドマツのためにすべてのPCR反応は、それぞれの20μlの0.2 UのPhusionを含む高FidilityのDNAポリメラーゼ（Finnzymes、エスポー、フィンランド）、1 × Phusion HF緩衝液、各dNTP200μMの、0.3μMの最終体積で行われたフラグメントプライマーと25〜50 ngのcDNAを、標準的なPCRのプログラムは、温度60〜55 ° C（タッチダウン-1 ° C /サイクル）55に続く℃をアニールで使用されましたメーカーの推奨と長いプローブによれば約100〜150 bpに消化された;すべての3つの種のセンスとアンチセンスcRNAプローブは、DIG RNAラベリングキット（ロシュダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツSP6/T7）を使用してin vitro転写で合成した3に記載のNa 2 CO 3緩衝液を用いてフラグメント。 結果ここに結果のセクションで我々は、 現場実験での標準的な結果の3つの異なった例を説明します。 雄と雌の器官のアイデンティティーを指定することによって、裸子植物と被子植物の生殖を制御する遺伝的メカニズムは、10前2.85億年区切られた二つの種子植物の系統にもかかわらず、進化的に保存7月9日のように見えます。 A.でシロイヌナズナの花のホメオティック遺伝子APETALA3（AP3 11）とPISTILLATA（PI 12）必要と花のコンテキスト内で雄の生殖系発達を指定するのに十分であり、この関数は13リネージュ被子植物の中で保存されるように見えます。花を欠いていると、別の男性と女性の円錐（図1A – C）に配置された彼らの生殖器官を持っている裸子植物で、AP3とPIへの相同遺伝子は、特に男性のコーン、microsporophylls 7,14の花粉ベアリングの臓器で発現される。したがって、被子植物と裸子植物の両方の相同遺伝子の同様のセットは、花粉有利子臓器を定義しています。 それぞれ、AtAP3とBnAP3に対して向けられた遺伝子特異的プローブは、Aの渦巻きtwoとthreeに対応する地域の若い花芽のステージ3からの信号を与えたシロイヌナズナとB.セイヨウ 。後に信号が発展途上の花びらと雄しべ（図2AおよびB）に制限されていた芽を上演した。これらの結果は、以前の研究11,15,16と一致している。 P.のAP3ホモログに向けプローブトドマツ、DAL13、P.のmicrosporophyllsで生成される信号トドマツ男性のコーンは、両方の頂端分裂組織の終了の前と後（図2CおよびD）、などのこれまでの研究7,14から期待。センスプローブは、バックグラウンド（図3A – Bとデータは示していない）上記のない信号は明らかにしなかった。一緒に取られて、これらの結果は、Aの発現を示すシロイヌナズナのAP3とBのそのオルソログセイヨウとP.雄の生殖器官の開発にモミ属 。 図1。A.thalianaとB.針葉樹P.の男性のコーンを生産セイヨウの花と花粉トドマツの写真は花のつぼみとA.thalianaとB.napuの開放花と花序を表示AとBそれぞれでの。雄しべと心皮;無菌の花被から離れて、被子植物の花は雌雄の生殖器官の両方を庇護することに注意してくださいCに示すように裸子植物Pの小枝さ緑の植物の針と赤の生殖、雄コーンとモミ属 。 図2 Aの発現シロイヌナズナのAP3とBの相同遺伝子セイヨウとP.モミ属 。顕微鏡写真は、Aの縦断面を示すシロイヌナズナとB. AとB、それぞれとP.におけるセイヨウ花序CとDのモミ属の雄コーン。のセクションでは、2番目と3番目の渦巻き花器官のBショーの信号でとBnAP3でAtAP3に対して向けられたアンチセンスプローブとハイブリダイズした。数字は、スマイス5に従い、花の段階を示している。 DAL13遺伝子に向けアンチセンスプローブは、P.の花粉ベアリングmicrosporophyllsに信号を与えたとしてCDに示すようにモミ属の雄コーン、。 microsporophyllsの例は、矢印で示されている。ハイブリダイゼーション信号にADポイントの矢印は、これは紫が表示されます。 CとDのフェノール化合物で、中央の髄内の個々のセルに茶色がかった非特異色を与える。の、がく片、P、花びら、ST、雄しべ、C、心皮、ミリ秒、小胞子葉、π、髄、PP、事前に花粉細胞。バー：100μmである。 P.から男性の円錐における図3。DAL13表現モミ属 。すべての顕微鏡写真は、（AH）、頂端分裂組織の終了後に男性の円錐の縦断面を見せている。矢頭は、DAL13が発現される細胞の種類を指している。 AとBのセクションは、バックグラウンド染色を決定するためにセンス制御プローブとハイブリダイズされています。 C Hの顕微鏡写真をDAL13アンチセンスプローブとハイブリダイズされています。 RNase A処理がある場合とない場合の実験からのセクションは、Gはそれぞれ、E、D、F、HおよびCに示されています。 1μg/ mlのプロテ​​イナーゼKでの実験からの顕微鏡写真をEとFの3μg/ mlを、CおよびDに示すように、とGとHバーの5μg/ mlのされています：100μmである。