Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג'ין

חלק 1: ייצור ביצה אוסף בלילה לפני זריקה, להגדיר את הדגים רבייה טנקים עם חוצצים במקום. כדי להגדיל את הייצור הכולל ביצה, דגים ניתן להגדיר יחס של שתי נקבות על זכר אחד אם תרצה בכך. למחרת בבוקר, אחרי האורות בחדר נדלק, למשוך את חוצצים מטנקים מספר ולאפשר כ 20 דקות של זמן הזיווג באין מפריע. בעזרת מסננת, לאסוף את הביצים מן הכלובים לגידול ולשטוף אותם במים ביצה. יוצקים את הביצים לתוך צלחת פטרי עם מים ביצה מופרית להסיר ביצים ופסולת עם פיפטה העברה. דגים יכולים להיות נערכו מחדש במיכלים גדולים כדי לייצר סיבובים נוספים של ביצים להזרקה. התאם את העיתוי של איסוף ביצים כדי לאפשר מספרים המרבי של ביצים להיות מיוצר מבלי לאפשר להם לעבור את השלב תא בודד. המקום שקופיות מיקרוסקופ במכסה הפוכה של צלחת פטרי 100mm. השתמש פיפטה להעביר בשורה את הביצים על הצד של המגלשה להרכיב עמודה בודדת. הסרה של עודפי מים ביצה משקופית על ידי לחיצה Kimwipe נגד הצד הנגדי הביצים. (איור 1A) חלק 2: משיכת המחט, טעינה, והכנת עם חולץ micropipette, למשוך כוס 1.0mm OD נימי לשתי מחטים חנות בצלחת פטרי 150mm ידי הנחת מעל רמפות מרק טיפשי. מחטים יכול להיות משך מראש. מחט Backload עם μL 3 של חומר ההזרקה באמצעות פיפטה microloader. נער את בולוס לעבר קצה המחט עד כמה יש בועות או לא הנותרים. הפעל את מקור האוויר microinjector. הכנס את המחט לתוך microinjector ולהבטיח חותם חזק בתוך הדיור. בדוק micromanipulator נמצא במצב תקין כדי לאפשר מגוון רחב של תנועה והסתגלות. תביאו את קצה מחט לתוך מטוס המבט של מיקרוסקופ, גבוה מעל הבמה, להתמקד באזור הדק של קצה. השתמש זוג מלקחיים חדה לצבוט את מחט בנקודה אשר משאיר המחט צר מספיק כדי לחדור את סיסית וחלמון אבל עדיין מסוגל לספק גודל חרוז עקבי. טיפה של שמן מינרלי על מיקרומטר ניתן להשתמש כדי לחשב את עוצמת הקול של כל הזרקה. כאשר מוזרק לתוך השמן, חרוז בקוטר של 0.1 מ"מ מכיל 500 PL של חומר ההזרקה (1B דמות); כרכים הזרקה של 500 PL או 1nL משמשים בדרך כלל. לדכא את דוושת רגל ולנטר את גודל חרוז בעוד זמירה את המחט והתאמת לחץ ההזרקה לפי הצורך. כרכים הזרקת אידיאלי תמלא כ 10% מנפח הביצה. איכות קצה מחט הוא חיוני כדי להקל על שניהם הזרקת ואת איכות ועקביות של התוצאות. חלק 3: הזרקה ודא העוברים לא התפתחו מעבר לשלב ארבע התא. באופן אידיאלי, עוברים צריך להיות בשלב אחד התא. מנמיכים את המחט לכיוון הטור של ביצים, מחזיק את המנה במקום עם היד מול שלך. פירס את פני השטח של סיסית והזן את החלמון במכה אחת חלקה תוך כדי צפייה לכל ריסוק או קריעה של שק החלמון. להזריק את חומר הזרקה לתוך החלמון (דמות 1C). הימנע הזרקת בועות אוויר או מתיחת חלמון כמו גם יכול להיות קטלני לעובר. עבודה לאורך הקו, להתאים את הלחץ הדרוש כדי לשמור על גודל חרוז עקבית, באמצעות קצה פיפטה, להסיר ביצים שנראים מופרית או נהרסים בתהליך הזרקה. לאחר השלמת עמודה של ביצים, להשתמש בזרם עדין של מים ביצה להעביר את הביצים מוזרק לתוך צלחת פטרי נקי. חזור על פי הצורך. שמור עוברים uninjected מספר כביקורת. בסוף של יום אחד, להסיר עוברים מתים להקליט את מספר העוברים מוזרק. החלף את המים ביצה בצלחת מעת לעת כדי להקטין את הסיכוי לזיהום. חלק 4: תוצאות נציג תלוי מה זה להיות מוזרק, העוברים עשויים לשרוד בקצב נמוך יותר מאשר אחים uninjected שלהם. למרבה המזל, קל להזריק מספרים עצומים של אותם, אז זה רק לעתים נדירות בעיה. זה נורמלי morphants להציג הפיתוח מתעכב מעט. כדי להמחיש את התוצאות של microinjection, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לתפעל את רמות החלבון הלב של זכוכית (Heg). Heg הוא חלבון הטרנסממברני הדרושים לפיתוח לב נורמלי. בהעדר שלה, עוברים לפתח לבבות עם קטעי יבוא ענק ותאי 1. אנו מזריקים two morpholinos מתואר בעבר נגד heg, heg_e3i3_egfr1 ו heg_e4i4_egfr2, בריכוז של 500 מיקרומטר. בשלב ההפריה 2 ימים הודעה, שולט אח uninjected נראים תקינים, כצפוי (2A דמות ו-B). עוברים הזריקו heg_e3i3_egfr1 יש בצקת במוח (דמות 2C). למרות ליבם של רוב morphants אלה שינו את המורפולוגיה, חדרי שלהם הם בגודל רגיל (דמות 2D). עוברים מוזרקעם heg_e4i4_egfr2 מומים בלב התערוכה משתנה. חלקם נראים תקינים, בעוד אחרים יש שטחים גדולים יבוא אטריה מוגדל בינוני (2E דמות ו-F). מוטציה heg, כפי שדווח בעבר 1, יש דרכי יבוא מוגדל עצומה ו אטריום (דמות 2G ו-H). אנחנו גם עוברים wildtype מוזרק עם mRNA 400 ng / μL עיבד מ heg באורך מלא cDNA. אמנם שולטת uninjected להתפתח בצורה תקינה (איור 3A ו-B), עוברים הזריקו heg mRNA בתערוכה מגוון של פנוטיפים החל המראה wildtype כדי cyclopia חמור, קיצור של ציר הגוף העיקרי, נמק של הראש והגוף, ועל ליקויים קו האמצע (דמות 3C ו-D). באיור 1. לעוברים להיות מוזרק הם נעמדו מול המיקרוסקופ שקופית בצלחת פטרי (A). נפח הזרקה נקבעת על ידי הזרקה לתוך שמן מינרלי דגש על מיקרומטר. נפח הזרקה של 500 PL, אשר נמצא בשימוש נפוץ, בעל קוטר של 0.1 מ"מ (B). מיד לאחר ההזרקה, morpholino או mRNA נראה כמו מקום להדגיש את החלמון (C). איור 2. בשלב ההפריה 2 ימים הודעה, עוברים uninjected אין פגמים ברוטו (א) או הפנוטיפ לב (B). עוברים מוזרק עם heg_e3i3_egfr1 morpholino יש בצקת במוח (C, חץ) אבל חדרי הלב בגודל רגיל (D). כמה עוברי מוזרק עם heg_e4i4_egfr2 morpholino יש קטעי זרימה מוגדלים אטריה (E, F). מוטנטים heg יש קטעי יבוא מוגדל קשה אטריה (G, H). (א), (ג), (E), ו – (G) הם תמונות DIC 4x, (ב), (ד), (F) (H) הם 20x תמונות DIC. אטריום = זה = בדרכי יבוא. איור 3. הפריה בגיל 24 שעות לכתוב, uninjected עוברי יש גוף ארוך, ישר, ללא פגמים או נמק קו האמצע (א) ושתי עיניים מוגדרים בבירור עם צינור עצביים ביניהם (B). כמה עוברי הזריקו mRNA heg, לעומת זאת, התערוכה ציר הגוף מקוצר, נמק, somites מעוותות (ג), ו cyclopia (ד '). (א) ו – (ג) הם תמונות DIC 4x, (ב) ו – (ד) הם 20x תמונות DIC.