Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

Teil 1: Egg Produktion und Sammlung Die Nacht vor der Injektion, richten Sie den Fisch in Zuchtbecken mit Trennwänden in Platz. Zur Erhöhung der Gesamtzahl der Eierproduktion, können die Fische in einem Verhältnis von zwei Frauen eingestellt werden, um ein Männchen, falls gewünscht. Am nächsten Morgen, nach der Raumbeleuchtung eingeschaltet, ziehen Sie den Teilern von mehreren Tanks und damit für etwa 20 Minuten ungestört Paarungszeit. Mit einem Sieb, sammeln die Eier aus der Zucht Käfige und spülen Sie sie mit Ei Wasser. Gießen Sie die Eier in einer Petrischale mit Ei Wasser und entfernen unbefruchteten Eiern und Schmutz mit einem Transfer-Pipette. Fische können in größeren Tanks zusammengefasst werden, um zusätzliche Runden von Eiern für die Injektion zu produzieren. Passen Sie den Zeitpunkt der Entnahme der Eizellen, um eine maximale Anzahl von Eiern, ohne dass sie passieren die einzelnen Zell-Stadium hergestellt werden können. Legen Sie einen Objektträger in der umgekehrten Deckel eines 100mm Petrischale. Verwenden Sie einen Transferpipette antreten die Eier gegen die Seite des Schiebers bilden eine einzelne Spalte. Entfernen Sie überschüssiges Wasser aus dem Ei gleiten durch Drücken einer Kimwipe gegen die gegenüberliegende Seite der Eier. (Abbildung 1A) Teil 2: Nadel ziehen, Lade-und Vorbereitung Mit einer Mikropipette Abzieher, ziehen Sie einen 1,0 mm OD Glaskapillare in zwei Nadeln und an einem 150mm Petrischale indem über Silly Putty Rampen. Needles kann im Voraus gezogen werden. Backload die Nadel mit 3 ul von Injektionsmaterial mit einem Microloader Pipette. Schütteln Sie die Bolus in Richtung der Nadelspitze bis es wenige oder gar keine Blasen mehr vorhanden sind. Schalten Sie die Luftquelle und Mikroinjektor. Legen Sie die Nadel in die Mikroinjektor und versichern eine gute Abdichtung innerhalb des Gehäuses. Prüfen Sie, ob der Mikromanipulator in eine geeignete Position, um für eine breite Palette von Bewegung und Anpassung zu ermöglichen. Bringen Sie die Nadelspitze in die Ebene der Sicht des Mikroskops, hoch über der Bühne, und konzentrieren sich auf die dünnste Bereich der Spitze. Verwenden Sie ein Paar scharfe Zange kneifen Sie die Nadel an einem Punkt, der die Nadel schmal genug zu durchdringen das Chorion und Dotter, aber immer noch der Lage, eine konsistente Perlgröße Blätter. Ein Tropfen Mineralöl auf einem Mikrometer können verwendet werden, um die Lautstärke der einzelnen Injektion zu berechnen. Wenn in das Öl eingespritzt wird, enthält eine Perle mit einem Durchmesser von 0,1 mm 500 pL von Injektionsmaterial (Abbildung 1B); Injektionsvolumina von 500 pL oder 1nL werden üblicherweise verwendet. Drücken Sie das Fußpedal und überwachen die Größe der Raupe beim Trimmen der Nadel und die Anpassung der Einspritzdruck je nach Bedarf. Ideal Injektionsvolumina füllt ca. 10% des Eies Volumen. Die Qualität der Nadelspitze ist von entscheidender Bedeutung, um sowohl die einfache Injektion und die Qualität und Konsistenz der Ergebnisse. Teil 3: Injection Sicherstellen, dass die Embryonen nicht über die Vier-Zellen-Stadium entwickelt. Idealerweise sollte Embryonen im Ein-Zell-Stadium werden. Senken Sie die Nadel auf die Spalte von Eiern, hält das Gericht an Stelle mit der anderen Hand. Pierce die Oberfläche des Chorion und geben Sie das Eigelb in einem gleichmäßigen Lauf, während Sie für jede Brechen oder Reißen der Dottersacks. Spritzen Sie das Injektionsmaterial in den Dotter (Abbildung 1C). Vermeiden Sie die Injektion von Luftblasen oder Strecken der Dotter entweder kann tödlich sein, um den Embryo. Arbeiten auf der ganzen Linie, stellen Sie den Druck wie nötig, um eine konsistente Perle Größe und mit einer Pipettenspitze zu erhalten, entfernen Sie die Eier unbefruchtet schauen oder während der Injektion zerstört. Nach Abschluss einer Säule von Eiern, mit einem sanften Strom von Ei-Wasser in den injizierten Eier in eine saubere Petrischale bewegen. Bei Bedarf wiederholen. Halten Sie mehrere injizierten Embryonen als Kontrolle. Am Ende des ersten Tages, entfernen abgestorbene Embryonen und notieren Sie die Anzahl der injizierten Embryonen. Ersetzen Sie das Ei Wasser in die Schüssel in regelmäßigen Abständen, um die Chance einer Infektion zu verringern. Teil 4: Repräsentative Ergebnisse Je nachdem, was wird gespritzt haben, kann Embryonen mit einer niedrigeren Rate als ihre injizierten Geschwister überleben. Glücklicherweise ist es einfach, eine große Anzahl von ihnen injizieren, so ist dies selten ein Problem. Es ist normal, morphants leicht verzögerte Entwicklung aufweisen können. Zur Veranschaulichung der Ergebnisse der Mikroinjektion, haben wir dieses Protokoll auf ein Niveau des Proteins Heart of Glass (HEG) zu manipulieren. Heg ist ein Transmembranprotein für normale Entwicklung des Herzens notwendig. In seiner Abwesenheit zu entwickeln Embryonen Herzen mit riesigen Zustrom Traktate und Kammern 1. Wir injizierten zwei bisher unbeschriebene Morpholinos gegen heg, heg_e3i3_egfr1 und heg_e4i4_egfr2, bei einer Konzentration von 500 uM. Bei 2 Tage nach der Befruchtung, werden die injizierten Geschwister steuert normal, wie erwartet (Abb. 2A und B). Embryonen mit heg_e3i3_egfr1 gespritzt haben Hirnödem (Abbildung 2C). Obwohl die Herzen der meisten dieser morphants Morphologie verändert haben, sind ihre Kammern normal dimensionierte (Abbildung 2D). Embryonen injiziertmit heg_e4i4_egfr2 weisen variable Herzfehler. Manche erscheinen normal, während andere große Zustrom Traktate und mäßig vergrößert Vorhöfen (Abb. 2E und F) haben. Die HEG-Mutante, wie zuvor 1 berichtet, hat eine enorm vergrößerte Einflusstrakt und Atrium (Abb. 2G-und H). Wir haben auch Wildtyp-Embryonen mit 400 ng / ul mRNA aus voller Länge heg cDNA umgeschrieben injiziert. Während injizierten Kontrollen normal entwickeln (Abb. 3A und B), Embryonen mit heg mRNA weisen ein Spektrum von Phänotypen von Wildtyp-Auftritt zu schweren Zyklopie injiziert, Verkürzung der Hauptteil Achse, Nekrose des Kopfes und des Körpers, und Spaltbildungen (Abbildung 3C und D). Abbildung 1. Embryonen injiziert werden gegen einen Objektträger in eine Petrischale (A) gefüttert. Injektionsvolumen wird durch Injektion in Mineralöl auf einem Mikrometer platziert bestimmt. Ein Injektionsvolumen von 500 pL, die üblicherweise verwendet wird, hat einen Durchmesser von 0,1 mm (B). Unmittelbar nach der Injektion wird der Morpholino-oder mRNA sichtbar als punctuate Ort in den Dotter (C). Abbildung 2. Nach 2 Tagen nach der Befruchtung haben injizierten Embryonen keine grobe Mängel (A) oder Herz-Phänotyp (B). Embryonen mit dem Morpholino heg_e3i3_egfr1 gespritzt haben Hirnödem (C, Pfeil), aber in der Regel großen Herzkammern (D). Einige Embryonen mit dem Morpholino heg_e4i4_egfr2 gespritzt haben vergrößerten Zufluss Traktate und Vorhöfe (E, F). HEG-Mutanten eine stark vergrößerte Zufluss Traktate und Vorhöfe (G, H). (A), (C), (E) und (G) sind 4x DIC Bilder; (B), (D), (F) und (H) sind 20x DIC Bilder. a = Atrium, it = Einflusstrakt. Abbildung 3. Nach 24 Stunden nach der Befruchtung, nicht injizierten Embryonen haben einen langen, geraden Körper ohne Nekrose oder Spaltbildungen (A) und zwei klar definierte Augen mit einem Neuralrohr zwischen ihnen (B). Einige Embryonen mit heg mRNA injiziert, zeigen dagegen eine verkürzte Körperachse, Nekrose, deformierte Somiten (C), und Zyklopie (D). (A) und (C) sind 4x DIC Bilder; (B) und (D) sind 20x DIC Bilder.