In vielen Fällen benötigen Enzyme zusätzliche Moleküle, sogenannte Cofaktoren, um zu funktionieren. Diese Hilfsmoleküle können entweder als Metallionen oder als organische Nicht-Proteinmoleküle klassifiziert werden. Beispielsweise bindet der Cofaktor Magnesium während des ersten Schrittes der Glykolyse an ATP, wodurch die Bindung zwischen zwei der Phosphatgruppen gestärkt wird. Diese Aktion ermöglicht der letzten Phosphatgruppe eine leichter durch die Enzym Hexokinase freigesetzt zu werden, wodurch Glucose in Glucose-6-phosphat umgewandelt wird. Daher bindet sich Magnesium als Cofaktor an das ATP, und erhöht dessen Effizienz. Die andere Untergruppe der Cofaktoren, die Coenzyme, sind organische Verbindungen, in der Regel Derivate von Vitaminen. Beispielsweise ist Vitamin C ein wichtiges Coenzym bei der Synthese des Proteinkollagens. Wenn sich Kollagen an seine Enzym Hydroxylase bindet, bindet sich dann Vitamin C an das Enzym und spendet eine Hydroxylgruppe. Jetzt kann die hydrolysierte Hydroxylase dazu beitragen, die Form des Kollagens in seine endgültige dreifache Helixstruktur zu ändern, die für die Aufrechterhaltung wichtiger Körpergewebe wesentlich ist.