Pseudomonas aeruginosa infecção causa morbidade significativa em hosts vulneráveis. A biblioteca de mutantes de inserção transposon não redundante da estirpe de p. aeruginosa PA14, designado como PA14NR definida, facilita a análise da funcionalidade do gene em inúmeros processos. Apresentado aqui é um protocolo para gerar cópias de alta qualidade da biblioteca mutante PA14NR definido.