Isolamento da medula óssea de camundongos neonatais e preparação de macrófagos derivados da medula óssea
Summary
Este protocolo descreve um método não enzimático e direto para isolar células da medula óssea de camundongos neonatais de 7 a 9 dias de idade e gerar macrófagos diferenciados usando um sobrenadante de células L929 como fonte de fator estimulador de colônias de granulócitos (M-CSF). Os macrófagos derivados da medula óssea foram posteriormente analisados quanto aos antígenos de superfície F4/80, CD206, CD11b e competência funcional.
Abstract
Várias técnicas para isolar a medula óssea de camundongos adultos foram bem estabelecidas. No entanto, isolar a medula óssea de camundongos neonatais é desafiador e demorado, mas para alguns modelos, é translacionalmente relevante e necessário. Este protocolo descreve um método eficiente e direto para preparar células da medula óssea de filhotes de 7 a 9 dias de idade. Essas células podem então ser isoladas ou diferenciadas em tipos específicos de células de interesse. Os macrófagos são células imunológicas cruciais que desempenham um papel importante na inflamação e infecção. Durante o desenvolvimento, os macrófagos neonatais contribuem significativamente para a remodelação tecidual. Além disso, o fenótipo e as funções dos macrófagos neonatais diferem daqueles de seus homólogos adultos. Este protocolo também descreve a diferenciação de macrófagos neonatais das células isoladas da medula óssea na presença de meio condicionado por L929. Marcadores de superfície para macrófagos neonatais diferenciados foram avaliados por meio de análise por citometria de fluxo. Para demonstrar a funcionalidade, a eficiência fagocítica também foi testada usando Escherichia coli conjugada com corante sensível ao pH.
Introduction
A medula óssea envolve populações de células-tronco hematopoiéticas e mesenquimais que são auto-renováveis e podem ser diferenciadas em várias linhagens celulares. As células-tronco hematopoiéticas na medula óssea dão origem a linhagens mieloides e linfóides1. As células-tronco mesenquimais produzem osteoblastos (osso), adipócitos (gordura) ou condrócitos (cartilagem)2. Essas células têm múltiplas aplicações no campo da biologia celular e engenharia de tecidos, incluindo terapia gênica 3,4. As células progenitoras presentes na medula óssea se diferenciam em tipos celulares específicos na presença de fatores de crescimento específicos da linhagem. A eritropoietina promove a proliferação de células progenitoras eritroides, o fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) estimula o crescimento de colônias de neutrófilos e a trombopoetina regula a produção de plaquetas como alguns exemplos de fatores de crescimento específicos da linhagem5. O FACS marcado com antígeno de superfície celular e a classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) são métodos bem estabelecidos para isolamento e purificação dos tipos específicos de células derivadas da medula óssea6.
Embora os estudos neonatais estejam avançando para encontrar as causas das mortes neonatais e abordar as complicações durante os partos prematuros, o desenvolvimento terapêutico direto continua sendo uma necessidade médica não atendida. Smith e Davis afirmaram: “Os pacientes pediátricos permanecem órfãos terapêuticos”7. Existem vários desafios, como amostras pequenas, efeitos do resultado ao longo da vida e questões éticas na obtenção de consentimento em estudos clínicos de neonatos8. Portanto, há uma alta demanda por modelos de estudo in vivo e in vitro específicos para neonatos para alcançar relevância translacional. Devido às semelhanças entre os níveis anatômicos e teciduais, períodos gestacionais curtos e tamanhos de ninhada, os roedores são o sistema modelo de mamíferos mais estudado.
Aqui, descrevemos um procedimento detalhado, altamente viável e reprodutível para isolar a medula óssea de filhotes de camundongos de 7 a 9 dias de idade e sua capacidade de se diferenciar em macrófagos. No entanto, uma variedade de linhagens celulares pode ser alcançada com o uso de sinais de diferenciação distintos. Também demonstramos a presença de marcadores de superfície celular e a presença de atividade fagocítica in vitro esperada para macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs).
Protocol
Representative Results
Discussion
Pesquisas envolvendo modelos de camundongos neonatais podem apresentar uma série de desafios. Os neonatos têm um sistema imunológico em desenvolvimento que é único em comparação com os adultos8. Como tal, os dados gerados a partir de modelos animais adultos não devem ser considerados aplicáveis a recém-nascidos, e vários trabalhos publicados articularam bem essa ideia18,19. Portanto, modelos específicos para neonatais e fontes …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health [R01 AI163333] para CMR. Reconhecemos o apoio financeiro adicional fornecido à Instalação de Citometria de Fluxo e Núcleo de Célula Única da West Virginia University pelas seguintes doações: WV CTSI grant GM104942, Tumor Microenvironment CoBRE grant GM121322 e NIH grant OD016165.
Materials
| 40 µm strainer | Greiner | 542040 | Cell culture |
| 96 well round (U) bottom plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | Cell culture |
| Anti-mouse CD11b-BV786 | BD Biosciences | 740861 | FACS analysis |
| Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488 | BD Biosciences | 141709 | FACS analysis |
| Anti-mouse F4/80-PE | BD Biosciences | 565410 | FACS analysis |
| Countess3 | Thermo Scientific | TSI-C3ACC | Automated cell counter |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Cell culture |
| DMSO | VWR | WN182 | Cell culture |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | Cell culture |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | Infection |
| EVOS FL | Invitrogen | 12-563-649 | Cell Imaging System |
| FBS | Avantor | 76419-584 | Cell culture |
| FluoroBright BMDM | Thermo fisher Scientific | A1896701 | Dye free culture media |
| Glutamine | Cytiva | SH30034.01 | Cell culture |
| HEPES | Cytiva | SH30237.01 | Cell culture |
| L-929 | ATCC | Differentiation | |
| LSRFortessa | Becton Dickinson | Flowcytometer | |
| Lysotracker red DND 99 | Invitrogen | L7528 | Fluorescent dye |
| MEM | Corning | 15-010-CV | Cell culture |
| Penicillin /streptomycin | Hyclone | SV30010 | Cell culture |
| pHrodo green STP ester | Invitrogen | P35369 | Fluorescent dye |
| T75 flask | Cell star | 658170 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300120 | Cell culture |
| Zeiss 710 | Zeiss | P20GM103434 | Confocal |
Referências
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