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Neurociência

Modélisation de l’exposition hautement répétitive à des explosions de faible intensité chez la souris

Published: May 24, 2024
doi:
10.3791/66592
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1United States Army Special Operations Command, 2CU Anschutz Center for COMBAT Research, Department of Emergency Medicine,University of Colorado School of Medicine, 3University of Washington School of Nursing, 4University of Delaware School of Nursing, 5Veterans Affairs Northwest Mental Illness Research, Education, and Clinical Center (MIRECC),VA Puget Sound Health Care System, 6Department of Psychiatry and Behavioral Sciences,University of Washington School of Medicine

Summary

On présente ici des méthodes pour produire des expositions répétées à des explosions de faible intensité à l’aide de souris.

Abstract

L’exposition à des explosions explosives est un facteur de risque important de traumatisme crânien chez les personnes exposées. Bien que les effets des grandes explosions sur le cerveau soient bien compris, les effets des petites explosions telles que celles qui se produisent lors de l’entraînement militaire sont moins compris. Cette petite exposition à une explosion de faible intensité varie également considérablement selon le groupe professionnel militaire et le rythme de l’entraînement, certaines unités subissant peu d’expositions au cours de plusieurs années, tandis que d’autres en subissent des centaines en quelques semaines. Les modèles animaux sont un outil important pour identifier à la fois les mécanismes de blessure et les risques cliniques à long terme pour la santé après une exposition à une explosion de faible intensité. Des modèles capables de récapituler ce large éventail d’expositions sont nécessaires pour éclairer les résultats des blessures aiguës et chroniques dans ces profils de risque disparates.

Bien que les résultats après quelques expositions à des explosions de faible intensité soient facilement modélisés pour l’étude mécaniste, les expositions chroniques qui se produisent au cours d’une carrière peuvent être mieux modélisées par les paradigmes des lésions dues aux explosions avec des expositions répétées qui se produisent fréquemment pendant des semaines et des mois. Voici des méthodes de modélisation de l’exposition hautement répétitive à des explosions de faible niveau chez la souris. Les procédures sont basées sur des modèles de tubes pneumatiques établis et largement utilisés d’exposition au souffle en plein champ qui peuvent être mis à l’échelle pour ajuster les paramètres de surpression et le nombre ou l’intervalle des expositions. Ces méthodes peuvent ensuite être utilisées soit pour permettre des investigations mécanistes, soit pour récapituler les expositions régulières aux explosions de souffles des groupes cliniques à l’étude.

Introduction

L’exposition à une explosion de faible intensité (LLB) se produit lorsque des personnes ou des structures subissent une force explosive d’une ampleur relativement faible, résultant généralement de petits accidents industriels, de démolitions contrôlées ou de certaines activités d’entraînement militaire. En revanche, l’exposition à une explosion de haut niveau (HLB) implique une exposition à des amplitudes intenses et potentiellement destructrices de force explosive, couramment rencontrées dans les combats militaires, les attaques terroristes ou les explosions accidentelles à grande échelle. La principale distinction entre LLB et HLB réside donc dans l’intensité des événements explosifs et, par extension, dans la capacité des personnes exposées à tolérer des expositions répétées avant de subir des lésions physiques ou fonctionnelles. À cet égard, les effets de l’exposition au HLB ont tendance à être plus évidents que les effets de l’exposition au LLB. Pour cette raison, les personnes ayant une exposition importante à la LLB peuvent être exposées à un risque accru de lésions ou de déficits qui ne sont pas détectés jusqu’à ce que leurs effets cumulatifs deviennent discernables.

Les recherches en cours visent à améliorer notre compréhension de la façon dont les propriétés de l’exposition à l’explosion, telles que l’intensité ou la répétition, peuvent causer des blessures afin que nous puissions mieux orienter la prévention et la prise en charge médicale. En médecine militaire, il est d’une importance primordiale de comprendre les implications cliniques de l’exposition aux explosions et, par conséquent, il est nécessaire de disposer de modèles animaux capables d’éclairer ces résultats. Bien que les modèles animaux aient permis d’élucider les effets du HLB, les effets des expositions au LLB restent largement sous-étudiés. De nombreuses études de modélisation examinent les effets des surpressions de souffle proches ou supérieures à 10 livres par pouce carré (psi) de pression de pointe 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18, mais peu de rapports se concentrent sur des niveaux de pression allant de 1 à 7 psi 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31, 32,33,34,35,36, qui sont plus courants dans les environnements d’entraînement militaire 37,38,39,40 et se situent près du seuil historique de 4 psi pour une exposition environnementale sans danger. Ainsi, une diffusion plus large des méthodes d’étude des pressions de pointe fréquemment utilisées de LLB peut aider à catalyser des connaissances cliniques rapides pour une application à la médecine militaire et à l’optimisation des forces.

Une association significative entre le risque professionnel de LLB et divers diagnostics cliniques se dégage des enquêtes épidémiologiques sur la LLBmilitaire 41,42,43,44. Ces études soutiennent une relation dose-dépendante mal définie, les expositions répétitives à la LLB démontrant des risques accrus41. Cela suggère que l’augmentation de l’exposition cumulative aux explosions joue un rôle crucial dans l’élaboration des résultats cliniques dans les contextes militaires.

Des études antérieures de modélisation animale de LLB inférieures à 10 psi ont principalement utilisé des explosifs ou des systèmes de tubes de choc pour étudier les effets de l’exposition. Bien que ces modèles examinent généralement les effets d’une à trois expositions, ils ont néanmoins contribué à une compréhension croissante des conséquences mécanistes 19,20,30,31, neuropathologiques 29,31,33 et comportementales 19,20,23,25,32,34 , associée à des expositions à des explosions de faible intensité qui sont typiques de l’environnement d’entraînement militaire.

Des études portant sur des LLB uniques générées par des explosifs en plein champ ont rapporté des preuves de pathologies cérébrales subtiles et de changements de comportement fréquemment associés au stress post-traumatique. Woods et ses collègues24 n’ont pas été en mesure de détecter des lésions cérébrales microscopiques à 2,5-5,5 psi, mais ils ont détecté des changements quantitatifs dans les glycosphingolipides du tissu cérébral par spectrométrie de masse. En utilisant les mêmes pressions de pointe et la même conception expérimentale, Rubovitch et ses collèguesont observé des changements de comportement à la suite d’explosions qui se sont produites avec une absence similaire de pathologie cérébrale mesurée par microscopie optique. Cependant, dans une enquête pathologique ultérieure, des dommages ultrastructurels non ambigus à la myéline cérébrale, aux mitochondries, aux neurones et à la neurovascularisation ont été identifiés par microscopie électronique 29,30,31,32,33 chez des souris exposées à 6,7 psi LLB. Il est intéressant de noter que plusieurs études LLB utilisant des explosifs en plein champ avec des pressions de ~10 psi et moins rapportent environ 3 à 8 % de mortalité après une seule exposition25,36.

Des résultats similaires ont déjà été notés par plusieurs études utilisant des tubes de choc en laboratoire. Dans des études portant sur des LLB uniques produites par des tubes de choc, des preuves ont été trouvées de lésions cytosquelettiques neurales et de changements dans les schémas de décharge neuronale développés après l’exposition à une seule explosion de 1,7 psi22. À 4 psi, on a signalé que le dysfonctionnement du corps calleux accompagnait les déficits neurocomportementaux chez les rats exposés à la LLB23. Par rapport à la durée de l’explosion mesurée dans l’air, Chavko et ses collèguesont constaté que la durée de la phase positive de la surpression de l’explosion était significativement plus longue dans le cerveau des rats exposés à 5,8 psi. Les biosignatures de réponses similaires aux lésions peuvent être étayées par une étude chez la souris après une exposition à 7,5 psi dans laquelle Ahmed et ses collègues35 signalent des changements détectables dans les taux sériques de protéines spécifiques inflammatoires, métaboliques, vasculaires et neurales jusqu’à un mois après l’exposition. Fait intéressant, cette étude a également rapporté une mortalité de 4,5 % 24 heures après l’exposition.

Dans des études portant sur trois LLB à tube de choc au cours d’une seule séance d’exposition de 20 minutes, des LLB entre 1,4 et 8,7 psi ont provoqué des augmentations de la pression intracrânienne (PIC) dépendantes du psi chez les rats, les changements observables de l’ICP prenant plus de temps pour un psi inférieur de20 et entraînant des changements cognitifs19,20. À l’aide de porcs, le même groupe a déterminé que trois expositions à 4 psi de LLB provenant d’une variété d’équipement militaire étaient suffisantes pour provoquer une neuropathologie histologique lorsque les animaux ont été placés dans des positions de tireur simulant l’utilisation humaine de l’équipement21.

Ces études illustrent collectivement les divers effets de l’exposition à la LLB qui peuvent se produire dans des conditions d’exposition limitée et de périodes de récupération. L’exposition répétée à la LLB semble induire des déficits cognitifs et comportementaux persistants, ce qui souligne la nécessité d’une compréhension nuancée des effets cumulatifs afin que nous puissions mieux déterminer quand ces effets peuvent devenir cliniquement significatifs ; cela est particulièrement pertinent pour les stagiaires militaires qui sont exposés à des niveaux élevés de LLB répétitifs. Pour y parvenir, de nouvelles études sont nécessaires, car la littérature actuelle ne modélise pas adéquatement les expériences cliniques d’expositions d’entraînement militaire de routine qui dépassent une à quelques explosions en quelques jours.

Les forces d’opérations spéciales (SOF) peuvent subir des LLB importantes et très répétitives lors d’expositions régulières. Une étude récente estime que l’exposition représentative, anonymisée à tous les postes d’une équipe de brèche explosive, peut atteindre 184 psi de pointe cumulés au cours d’une semaine de formation42. Ceci est basé, en partie, sur une estimation prudente de 6 charges de brèche utilisées par jour, avec une pression de pointe moyenne de 4 psi chacune, mesurée par des flotteurs montés sur le personnel ; Il ne tient pas compte des flashbangs et autres dispositifs45. Un cycle d’entraînement de routine peut durer plusieurs semaines. Pour faciliter l’étude des expériences cliniques de LLB, telles que celles des membres de la formation des FOS, nous présentons un modèle de tube de choc en laboratoire d’exposition hautement répétitive à des LLB. La méthode, basée sur les systèmes de tubes pneumatiques46, 47 et 48, permet des études hautement reproductibles de pressions de 2 psi et plus. La procédure ne dépend pas de facteurs externes tels que les conditions météorologiques, n’entraîne aucune mortalité observée et est réalisée en laboratoire. En conséquence, la méthode permet des expositions répétitives et prolongées et quotidiennes à la LLB chez les mêmes sujets pour des études qui durent des semaines ou des mois, facilitant ainsi l’investigation de haute fidélité de l’entraînement militaire.

Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées conformément au protocole #1588223, approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du système de soins de santé de Puget Sound et conformément au Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. 1. Soins aux animaux REMARQUE : Les modèles animaux de LLB sont limités uniquement par leur disponibilité et la capacité du tube de choc à s’adapter à leur taille. Le tube de choc décrit ici a été conçu spécifiquement pour être utilisé avec des souris. Utiliser des souris C57BL/6J mâles ou femelles de 3 à 4 mois ou d’autres souches/lignées de souris approuvées conformément aux besoins expérimentaux. Maintenez les souris sur un cycle sombre-lumière de 12 heures dans des installations exemptes d’agents pathogènes spécifiques avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les souris sont généralement logées socialement avec 4 ou 5 dans une cage. Maintenir la température de l’installation à 20-22 °C. Apportez des cages contenant des souris blast et des souris factices dans une zone d’attente à proximité. Apportez des cages vides séparées pour transférer les souris individuelles vers et depuis la salle de dynamitage. 2. Préparation du tube de choc (Contrôle de sécurité) Confirmez que les contrôles de sécurité nécessaires ont été effectués pour le système spécifique. Assurez-vous que l’alimentation en gaz (hélium) et l’alimentation principale sont coupées/déconnectées. Préparez les membranes au besoin pour le nombre précis de dynamitages de faible intensité à effectuer (figure 1.1). Coupez les dimensions de la membrane selon les besoins du tube de choc spécifique utilisé dans ce protocole :Coupez une feuille de film alimentaire en un carré de 5,5 « x 5,5 » pour sceller la bobine et lui permettre de se pressuriser. Coupez une feuille de papier de photocopieur standard de 8,5 x 11 po (poids 75 g/m,poids 2 ) à 5,5 x 11 po ; Pliez la feuille de papier obtenue en deux pour former un carré de 5,5 po x 5,5 po. Obtenir une feuille de membrane mylar de 500 G (125 μm d’épaisseur).REMARQUE : Ces feuilles ne sont pas rompues ou déformées de manière significative par le sablage standard de faible intensité et peuvent être réutilisées pour la durée d’une procédure d’une journée. Prenez un carré de film alimentaire et un carré de papier plié et disposez-les sur une surface plane (Figure 1.2). Placez le papier plié sur le film alimentaire et alignez-les le mieux possible (Figure 1.3). Pour accélérer les explosions répétitives, disposez toutes les piles de membranes maintenant. Insérez la membrane mylar entre le tournevis et la bobine en l’enroulant dans un petit tube (à peu près aussi grand que l’index ; Figures 1.4 et 1.5). Insérez-le complètement dans le mécanisme et relâchez-le pour lui permettre de se dérouler contre le joint en caoutchouc qui sépare la section du pilote de la bobine. Poussez la bobine vers le pilote pour fixer la feuille de mylar en place ; Cela permettra de desceller la bobine de la section entraînée du tube d’amortisseur. Placez les doigts sous la moitié supérieure du film alimentaire et roulez soigneusement le film alimentaire et le papier vers vous, en vous assurant qu’ils s’enroulent ensemble sans se désaligner (Figure 1.6). Insérez la pile de membranes entre la bobine et les sections entraînées du tube de choc (Figure 1.7). Laissez la pile de membranes se dérouler de sorte que le joint en plastique soit orienté vers la bobine et que le papier soit orienté vers la section entraînée du tube (Figure 1.8).REMARQUE : Cette orientation créera un joint étanche à l’air afin que le système puisse être pressurisé. Fermez la bobine (Figure 1.9,1.10). Le cas échéant, serrez les boulons à la main ou hydrauliquement, en fixant l’ensemble pilote-bobine-tube de choc afin que le système puisse être mis sous pression. (Contrôle de sécurité ; Graphique 1.10)REMARQUE : Pour les systèmes hydrauliques, assurez-vous que la pression cible de l’ensemble de fermeture est atteinte pour éviter les ratés d’allumage, qui peuvent nécessiter le remplacement de la membrane et ralentir le processus d’exposition LLB. Nous utilisons l’hydraulique pour fermer notre assemblage à 500 psi. 3. Préparation des animaux Allumez le coussin chauffant à circulation d’eau sous la chambre d’anesthésie, avec la température réglée sur 37 °C (Figure 1.11). Placez un tampon médical absorbant sur le coussin chauffant. Dans la salle d’attente, retirez une souris de sa cage d’accueil et placez-la dans une cage de transfert vide. Amenez la souris en cage dans la salle de dynamitage. Réglez le débit d’oxygène à 1,0 L/min (lpm) et le système de récupération sous vide (Figure 1.12). Allumez l’isoflurane à 5 % (pour induire une perte de conscience rapide) et acheminez le flux vers la chambre d’anesthésie des rongeurs (Figure 1.13). Placez la souris dans la chambre pour induire l’anesthésie (Figure 1.14). Une fois que la souris est complètement anesthésiée et qu’elle affiche une respiration stable pendant 30 secondes supplémentaires, plongez dans la chambre et donnez un coup de poing à la souris pour une identification sans ambiguïté à long terme de la souris tout au long du reste de l’étude. Il est nécessaire de faire cette étape maintenant pour éviter d’interférer avec les temps de récupération après l’explosion. Ensuite, appliquez un lubrifiant ophtalmique stérile sur les deux yeux pour éviter le dessèchement de la cornée. Retirez la souris de la chambre et placez son nez dans le cône nasal (Figure 1.15). Commutez le débit de l’anesthésie (par exemple, l’isoflurane) de la chambre d’induction au cône nasal. À l’aide de petits morceaux de ruban adhésif de laboratoire, maintenez légèrement les membres de la souris contre la civière (figure 1.16). Après avoir retenu la souris, placez une attache torsadée autour de chaque membre et tournez-la fermement, en fixant la souris à la civière au niveau des poignets et des chevilles (Figure 1.17). Placez une attache torsadée plus grande autour de la poitrine, en l’attachant très lâchement de sorte que la respiration de la souris ne soit pas restreinte. Cela servira de mécanisme de contention secondaire au cas où l’une des contraintes des membres se détacherait. Soulevez la queue de la souris et placez-la sous le pied gauche pour vous assurer qu’elle ne se coince pas lorsque la civière est insérée dans le tube de choc (Figure 1.18). 4. Procédure LLB Ouvrez la section d’exposition des animaux du tube de choc et orientez la souris de manière à ce qu’elle fasse face à l’onde de choc qui arrive (Figure 1.19). Sécuriser/suspendre la civière dans la section d’exposition des animaux (Figure 1.20). Fermez hermétiquement la porte pour la section d’exposition des animaux, en vous assurant que le tube d’écoulement de l’anesthésique n’est pas pincé par la porte (figure 1.21). Réduire l’anesthésie à 2,5-3 % d’isoflurane, 1 lpm pour le reste de la séance. Mettez le système sous tension comme il convient (Figure 1.22). Localisez et connectez la conduite d’alimentation de l’hélium gazeux comprimé (Figure 1.23, 1.24). Quittez la salle de dynamitage pour accéder à la console de commande du tube de soufflage dans une pièce adjacente et assurez-vous qu’il ne reste pas de personnel ou d’animal dans la salle de dynamitage.REMARQUE : L’établissement peut exiger des protections auditives ou les conditions opérationnelles. De telles conditions peuvent inclure des dispositions de tube de choc où le pupitre de commande est situé dans le même espace ouvert que le tube de choc. À partir de la console, allumez le logiciel d’acquisition pour enregistrer l’événement d’explosion (voir l’encadré vert de la Figure 1.25).REMARQUE : Pour ces procédures, nous collectons les données du capteur à une fréquence d’échantillonnage de 20 kilohertz (kHz), qui sont ensuite traitées à l’aide du logiciel LabView. Nous recommandons d’acquérir un échantillonnage de capteur à ≥10 kHz pour obtenir des courbes de temps en fonction de la pression de haute qualité. Désengagez tout verrou de sécurité (par exemple, les touches de commande de puissance, qui sont illustrées par une flèche verte sur la Figure 1.26). Fermez les deux évents de gaz et pressurisez passivement la bobine (Figure 1.27). N’utilisez pas le côté conducteur. Continuez à remplir jusqu’à ce que la membrane se rompe d’elle-même au pic psi cible, déterminé par le nombre de feuilles de membrane utilisées. Enregistrez la pression maximale, la durée de la phase positive et l’impulsion à l’emplacement de l’animal. (Figure 1.28). Désactivez le mécanisme de remplissage. Revenez au tube de choc, débranchez la conduite d’alimentation en hélium et coupez l’alimentation du circuit de commande de souffle (Figure 1.29). Pour effectuer des expositions répétées à la LLB sur le même animal, ouvrez la bobine, retirez la pile de membranes de la bobine, puis roulez et insérez une autre pile de membranes de la bobine (figures 1.30, 1.31, 1.32). Aplatissez l’empilement de membranes et refermez l’ensemble.REMARQUE : Pour modéliser l’expérience clinique d’expositions à des explosions de faible niveau pendant l’entraînement SOF défini empiriquement, nous exposons des souris à 5 à 6 LLB par jour, plafonnant les expositions quotidiennes à un total cumulatif prudent de ~20 psi45. Les études mettant l’accent sur les relations mécanistes et dose-réponse peuvent également choisir d’utiliser un nombre constant d’expositions à la LLB avec des paramètres de surpression définis par session. Après la LLB finale de l’animal actuel, retirez-le du tube de choc, en laissant l’anesthésie activée (Figure 1.33). Détachez l’animal pendant qu’il est sous anesthésie. Retirez-le du cône de nez d’anesthésie et placez-le sur le dos sur le coussin d’eau chauffé (Figure 1.34). Une fois que l’animal a été placé sur le coussin d’eau, démarrez une minuterie et notez le temps jusqu’à ce que la souris se retourne sur sa face ventrale (c’est-à-dire son estomac) d’elle-même (figure 1.35). Enregistrez ce temps comme temps de redressement. Une fois que la souris s’est rétablie, retournez-la dans la cage d’accueil et continuez à la surveiller au besoin. 5. Procédures de plusieurs jours Pour modéliser les expositions de routine à la LLB dues aux accusations de violation utilisées lors de l’entraînement SOF Close Quarter Battle, effectuez des expositions quotidiennes répétées sur les souris 5 jours par semaine (du lundi au vendredi) pendant un total de 15 jours sur 3 semaines de travail standard. 6. Modification des pressions de pointe LLB Augmentez la pression de pointe en utilisant des matériaux de membrane plus résistants ou en empilant simplement des membranes supplémentaires. Par exemple, utilisez la membrane Mylar Roll Clear 0,005 (500 G) pour produire une pression de pointe de ~20 psi (lorsqu’elle est utilisée à la fois comme membrane de pilote et de bobine) ou la membrane Mylar Roll Clear 0,002 (200 G) pour produire une pression de pointe de ~10 psi. Ajustez les paramètres de la durée de la phase positive et de l’impulsion de l’explosion pour répondre aux besoins expérimentaux. Pour ajuster les durées de phase positives et les impulsions, déterminez empiriquement les conditions cibles en remplaçant les sources de gaz comprimé47,49 ou en modifiant la longueur du pilote chaque fois que possible. Le protocole ci-dessus utilise l’hélium pour créer une pression de pointe et une forme d’onde similaires à une courbe de Friedlander idéalisée. 7. Prélèvement de tissus REMARQUE : Les pratiques de prélèvement de tissus peuvent être ajustées en fonction des besoins expérimentaux. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale avec 210 mg/kg de pentobarbital. Placez la souris dans une cage à souris ou à rat avec des barres ou un filet préfabriqué ; Placez la souris en cage dans une hotte. Une fois que la souris ne répond plus, placez-la sur le dos sur les barreaux au-dessus de la cage et fermez sa gueule autour de l’une des barres pour l’aider à rester en place pendant la perfusion. Saisissez la peau de l’estomac, tirez-la vers le haut et utilisez une paire de gros ciseaux pour percer un trou dans la cavité abdominale, en faisant attention de ne couper aucun des organes. Continuez à couper plus bas le long de la base des côtes pour permettre une articulation plus libre de la cage thoracique. À l’aide d’un hémostat, approchez-vous de la souris par le côté et saisissez le tissu directement sur le dessus de la cage thoracique, en roulant l’hémostat vers l’arrière pour maintenir la base de la cage thoracique inclinée dans une position facilement accessible. Utilisez une paire de pinces ou un outil similaire pour maintenir l’hémostat en place. À l’aide d’une petite paire de ciseaux chirurgicaux, coupez soigneusement le diaphragme pour permettre l’accès au cœur. À l’aide d’une paire de pinces, inclinez doucement le cœur de sorte que le bas soit directement tourné vers l’extérieur de la base ouverte de la cage thoracique. Agissez rapidement pour que le cœur batte encore pendant la perfusion. Si vous prélevez du sang, tenez le cœur à l’aide d’une pince et percez soigneusement le ventricule droit à l’aide d’une seringue de 3 ml munie d’une aiguille de 0,5 po et 25 g. Insérez par le bas du ventricule et allez-y dans le sens de la longueur, en faisant attention de ne pas percer le côté opposé du ventricule. Tirez doucement sur la seringue jusqu’à ce que 0,5 à 1,0 ml de sang ait été prélevé ou que le débit cesse, puis retirez la seringue. Utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux pour faire une petite incision dans l’oreillette droite afin de permettre au sang et au perfusat de s’écouler. Tenez le cœur à l’aide d’une paire de pinces et insérez soigneusement une aiguille papillon de 25 G dans le ventricule gauche, en l’insérant par le bas. Maintenez l’aiguille papillon en place à l’aide d’une pince de maintien ou à la main. Perfuser l’animal.Connectez une seringue contenant 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une aiguille papillon et perfuser à un débit d’environ 10 mL/min. Recherchez le blanchiment du foie comme signe d’une bonne perfusion. Une fois la seringue vidée, débranchez-la de l’aiguille papillon. Pour la préparation des tissus pour la microscopie, remplacer la seringue PBS vide par une seringue contenant 50 ml de solution de formol tamponné neutre (FBN) à 10 % ou de formaldéhyde à 4 %. Répétez les étapes ci-dessus pour perfuser avec du formol.REMARQUE : Il faut observer que la souris perfusée se contracte pendant la perfusion ; Cela devrait entraîner une rigueur ou une rigidité de tout le corps une fois la procédure terminée. Retirez l’aiguille du papillon du cœur et retirez la souris des barreaux de la cage pour la collecte de tissus. Prélever et sous-disséquer les organes cibles selon les besoins ; Veillez à effectuer des procédures sur la glace lorsque des matériaux frais et non fixés sont collectés. Congelez rapidement tous les tissus non fixés qui ont été collectés dans de l’azote liquide et stockez-les à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient utilisés dans des protocoles d’analyse de cibles de protéines ou d’ARN. Pour les tissus fixés, retirer dans un tube conique étiqueté de 50 ml rempli de formol (un tube par organe).

Representative Results

Tout en étudiant les résultats expérimentaux chez les souris après des expositions à des forces d’explosion explosives, l’enregistrement et la caractérisation de l’événement par l’analyse de la pression en fonction du temps sont cruciaux pour évaluer le succès de l’expérience. Cette méthode, qui consiste à mesurer les changements dynamiques de pression pendant l’explosion, aide les chercheurs à comprendre les effets des explosions sur les systèmes biologiques. Dans les expériences réussies, les enregistrements de pression présentent un modèle d’onde bien défini et contrôlé. L’augmentation de la pression est brusque, atteignant des valeurs maximales dans les temps prévus (Figure 2). La baisse de pression qui s’ensuit suit une courbe prévisible, illustrée par la forme d’onde de Friedlander, indiquant une dissipation efficace de l’énergie. En ce qui concerne l’évaluation des blessures, aucun signe manifeste de blessure n’est présent dans les expériences de LLB, même lors d’une exposition très répétitive à la LLB, avec jusqu’à six explosions se produisant en 15 à 20 minutes (figure 3). Cependant, une analyse des temps de redressement après une exposition répétée à la LLB indique que les souris blast reprennent conscience plus rapidement que les souris simulacres (figure 4). Ainsi, la LLB répétitive entraîne des changements reproductibles dans les réponses d’excitation neurocomportementale aiguë après l’exposition. Les expériences sous-optimales peuvent présenter des profils de pression irréguliers. Les cas où les pressions de pointe sont abaissées de manière inattendue peuvent indiquer une libération prématurée ou lente de gaz, empêchant la libération brutale de gaz sur toute la longueur de la section du tube de choc entraînée pour rencontrer l’animal dans la zone cible. La perte prématurée de pression du gaz est souvent le résultat d’une mauvaise étanchéité des sections de pilote ou de bobine. Cela peut résulter de défauts dans la membrane ou d’un serrage inadéquat de l’ensemble pilote-bobine-tube de choc. Dans de tels cas, les échantillons biologiques peuvent présenter des signes réduits de traumatisme. L’interprétation des données consiste à relier les profils pression-temps aux réponses biologiques observées. Les expériences réussies démontrent que les paramètres d’explosion choisis, tels que la pression de pointe et la durée, suscitent les réponses biologiques attendues ou établies à l’étude. Les corrélations entre les caractéristiques spécifiques de la pression et les résultats biologiques aident à établir des relations causales. Les études longitudinales sont rendues possibles par ce protocole en raison de l’absence de perte d’animaux observée pour les points temporels de l’étude jusqu’à 6 mois après la LLB finale (Figure 5). L’éventail des résultats cliniques après l’exposition à la LLB est subtil et mal compris. L’exposition répétée aux LLB a toujours été considérée comme sous-nocive pour les humains et les souris. Ceci est soutenu par un retour rapide à la marche, au comportement et à l’activité physique normaux après des expositions à 2-5 psi. Cependant, l’absence de symptômes neurosensoriels aigus accablants ou de changements de comportement n’exclut pas l’existence d’effets insidieux négatifs. Étant donné que les phénotypes liés à la LLB sont au mieux subtils, la gamme complète des effets est un domaine d’investigation active et peut nécessiter beaucoup de temps ou de répétitions pour provoquer des résultats cliniquement significatifs. Figure 1 : Étapes de la procédure pour le modèle de tube de choc de LLB murin répété. Après la préparation du tube de choc (étapes 1 à 10) et les étapes de préparation de l’animal (étapes 11 à 18), les souris sont exposées à une ou plusieurs LLB (étapes 19 à 32) avant d’être retirées du tube (étape 33). Les souris sont ensuite placées sur le dos sur un coussin chauffant réchauffé (étape 34). Le temps qu’il faut à l’animal pour se retourner sur sa face ventrale est enregistré comme le temps de redressement (étape 35). Abréviation : LLB = Souffle de faible intensité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Courbes pression-temps représentatives pour des expositions proches de 4 psi. (A) Les cheminées d’additifs fournissent des pressions de pointe linéaires dans la plage de 2 à 4,5 psi de crête. Profils représentatifs de pression en fonction du temps (millisecondes) moyennés de 3 à 6 explosions de tube de choc (rouge) par rapport aux courbes de Friedlander idéalisées (bleues) pour (B) 1 feuille, (C) 2 feuilles, (D) 3 feuilles et (E) 4 feuilles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Intervalle inter-sujets. La mise en place et l’exécution d’un seul jet nécessitent en moyenne 9,8 ± 1,9 min (moyenne ± erreur type de la moyenne (sem)). Les expositions supplémentaires à l’explosion nécessitent 1,7 ± 0,4 min supplémentaires par événement (moyenne ± sem). Les points représentent les résultats d’animaux individuels. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Temps de redressement quotidiens pendant 3 semaines d’expositions très répétitives à la LLB. Le graphique représente les temps de redressement normalisés simulés sur 3 semaines d’exposition à la LLB. Les souris LLB ont été exposées quotidiennement à 6 explosions, pour un total de 90 expositions à la LLB sur 15 jours. Les caractéristiques moyennes de surpression étaient (± sem) de 3,05 ± 0,07 psi de crête, de 0,94 ± 0,04 de durée de phase positive et de 2 ± 0,1 psi * msec d’impulsion. Les valeurs p reflètent les résultats de l’ANOVA à 2 facteurs. Abréviation : LLB = Souffle de faible intensité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Effets du modèle de LLB à tube de choc en laboratoire sur l’attrition des animaux à la suite d’expositions très répétitives à LLB. Taux d’attrition chez les souris fictives (N = 24) et les souris LLB (N = 32) à partir de la première exposition à la LLB (jour 1) jusqu’à toutes les expositions à l’étude (se terminant au jour 19) et après une période de récupération de 6 mois (jour 199). Il n’y avait pas de différence significative entre les taux d’attrition des groupes fictifs et des groupes LLB au cours de la période observée. Les souris LLB ont subi en moyenne 62 expositions à une moyenne de 4,78 ± 0,01 psi de crête et de 3,16 ± impulsion de 0,023 psi∙ms. Des expositions ont été administrées à des souris 5 jours par semaine (c.-à-d. du lundi au vendredi) pendant 3 semaines consécutives pour modéliser les expositions à la surpression des SOF récemment signalées lors de l’entraînement de routine45. Abréviation : LLB = Souffle de faible intensité ; SOF = Forces d’opérations spéciales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Nous ne pouvons pas traiter adéquatement ce que nous comprenons inadéquatement, et nous ne comprenons pas encore les mécanismes de blessure liés à l’exposition très répétitive à la LLB. De nombreux membres du personnel des FOS signalent l’apparition de troubles de la santé que l’on croit être liés à une exposition très répétitive à la LLB dans les cinq à dix ans suivant leur service opérationnel50,51. Certains membres du personnel des SOF développent des effets neurocognitifs semblables à ceux des lésions cérébrales traumatiques aiguës (TCC) immédiatement après l’exposition à la LLB39. De plus, les cliniciens signalent que les symptômes résultant de l’exposition à l’explosion sont souvent réfractaires aux traitements traditionnels, ce qui peut inciter les SOF et les cliniciens à se tourner vers d’autres traitements52,53. Malgré l’exposition fréquente des SOF à la LLB et aux mécanismes de surpression45, la gravité et la résistance au traitement des symptômes qui en résultent, et le modèle documenté de cicatrices astrogliales liées aux explosions51, les résultats à long terme sur la santé restent relativement inconnus. Les cliniciens et les dirigeants militaires s’appuient sur la recherche en modélisation pour découvrir les mécanismes de blessure et la physiopathologie. Ces modèles sont essentiels à l’élaboration de politiques et de stratégies visant à identifier, interrompre, prévenir et traiter le processus pathologique à un stade précoce.

De manière cruciale, la modélisation chez la souris des expositions courantes aux LLB militaires devrait éclairer les modèles de prédiction de la santé. La pratique clinique bénéficierait de modèles prédictifs de LLB qui identifient qui peuvent être les plus à risque de pathologie liée à l’explosion, quelles propriétés de l’explosion provoquent les résultats les plus graves et comment le processus de la maladie peut évoluer en fonction de la chronicité, de la posologie ou de la spécificité de l’exposition à l’explosion. Par conséquent, la modélisation de l’exposition répétitive aux LLB est essentielle pour élaborer des hypothèses et des prédictions sur l’impact des expositions sur les résultats de santé des SOF et des autres membres du Service. Les modèles de prédiction et de mécanisme de blessure éclaireraient les diagnostics et les traitements, ainsi que les décisions de retour au travail en fonction des symptômes et de l’exposition.

L’étude des traumatismes crâniens induits par les explosions chez la souris a connu des progrès significatifs au cours des dernières années, en particulier avec le développement de modèles qui prédisent les résultats après un traumatisme crânien léger chronique répétitif chez les humains54,55. Alors que l’étude de l’exposition aux explosions de niveau moyen à élevé à l’aide de tubes de choc est bien développée avec des centaines d’articles indexés par PubMed 46,56,57,58, l’utilisation de tubes de choc dans les études d’explosions à proximité de surpressions d’entraînement militaire de routine (<6 psi de pression de pointe 40) est moins développée, avec moins de dix articles identifiés dans une recherche récente de PubMed19,20, 22,23,26,27,28. Pour faciliter le développement de ce domaine peu étudié, le modèle présenté met l’accent sur les considérations clés pour les surpressions constantes de LLB chez la souris, la récupération après l’explosion et la surveillance, tout en notant plusieurs avantages distincts de ce modèle par rapport à l’utilisation d’explosifs en plein champ. En effet, nous soutenons que le modèle de LLB de laboratoire décrit peut permettre le développement de modèles prédictifs des résultats cliniques après une LLB chronique répétitive.

Le modèle LLB offre des avantages critiques par rapport aux modèles d’explosion explosive en plein champ, notamment en termes de bien-être animal. Les modèles en plein champ peuvent entraîner des taux de mortalité de 3 à 8 %25,36, tandis que ce modèle LLB en laboratoire ne montre aucune perte. Cette distinction est cruciale, en particulier lorsqu’il s’agit de simuler les expositions cumulatives élevées typiques de l’entraînement militaire, où pratiquement aucun stagiaire ne subit d’issue fatale à la suite d’une exposition à la LLB. L’absence apparente d’apnée ou d’autres causes de décès, telles qu’un traumatisme pulmonaire mortel, garantit la fiabilité et la cohérence du modèle, ce qui le positionne comme un choix privilégié pour les études sur les effets cliniquement pertinents de la LLB répétitive.

Ce protocole est spécifique à un tube de choc « ouvert » avec une conception en trois parties, composé d’un pilote, d’une bobine et de sections entraînées. Des LLB très répétitives peuvent être réalisables avec d’autres conceptions de tubes à chocs avec des modifications appropriées au protocole. Les modèles de tubes de choc ouverts sont fréquemment utilisés pour l’étude des neurotraumatismes induits par les explosions 46,47,48. Le tube de choc ouvert, doté d’une extrémité de sortie ouverte, permet à l’onde de choc générée de se propager librement sur toute la longueur du tube où elle rencontre sa cible (par exemple, le sujet animal) avant de sortir par l’extrémité opposée du tube. Cette conception facilite la reproduction et l’étude de surpressions primaires de souffle relativement pures se rapprochant des propriétés des explosions de souffle telles qu’elles se produiraient en plein champ48. En conséquence, la fidélité de l’onde de surpression de souffle mesurée empiriquement est comparée à une onde de Friedlander idéalisée ; Cela permet d’évaluer les performances du tube pour produire un événement de surpression spécifique. Pour modéliser l’exposition au LLB, nous utilisons untube de soufflage ouvert de 48 modèles sur mesure, conçu à l’origine pour reproduire les effets des détonations de HLB de plus de 200+ livres de trinitrotoluène (TNT) à une distance de sécurité de ~25 pieds. Pour permettre des surpressions de pointe élevées, un gaz est pressurisé dans le pilote, qui est séparé de la bobine par une membrane, scellant le gaz dans le pilote. La bobine, à son tour, est également séparée de la section ouverte par une autre membrane. Cette seconde membrane permet de pressuriser séparément la bobine. Le système à double chambre permet aux gaz dans le pilote d’être pressurisés au-delà du point de rupture normal de la membrane. Cela se produit parce que la bobine sous pression agit comme un tampon, soutenant la membrane à l’interface du pilote et de la bobine, empêchant ainsi sa rupture. Lorsque l’opérateur du tube de choc souhaite générer une onde de choc à la pression cible, une soupape électronique évacue le gaz de la bobine, abaissant rapidement la pression dans la bobine et permettant au gaz surpressurisé dans la section du pilote de rompre à la fois les membranes du pilote et de la bobine et de s’étendre rapidement sur toute la longueur du tube où il rencontre l’animal dans la zone cible. La principale modification permettant l’étude de la LLB dans les tubes haute performance de cette conception est que nous bloquons le pilote et n’utilisons la bobine qu’en combinaison avec des membranes à bas seuil.

Pour garantir la fiabilité et la reproductibilité des expériences LLB, certaines actions doivent être prises lors de la configuration. Il est crucial de bien fixer les bras et les jambes au niveau des poignets et des chevilles. Cela minimise la variabilité des mouvements corporels et l’exposition aux explosions et prévient les blessures involontaires qui pourraient fausser les résultats. De plus, la rotation des poignets et des chevilles vers l’intérieur aide à diriger le mouvement des appendices vers la ligne médiane de l’animal, réduisant ainsi le risque de blessures distales qui pourraient affecter les évaluations ultérieures des performances motrices. Le redressement de la tête et la courbure de la colonne vertébrale sont un autre facteur essentiel pour assurer une exposition uniforme au souffle sur tous les sujets, car il aide à réduire les différences potentielles d’amplitude de mouvement. Il est recommandé d’augmenter le pourcentage d’isoflurane utilisé pour l’anesthésie pour les protocoles s’étendant sur plusieurs jours ou semaines. Cet ajustement permet de maintenir une profondeur d’anesthésie constante tout au long de la durée prolongée de l’expérience. D’après notre expérience, une augmentation de 0,5 % d’isoflurane est suffisante pour maintenir une anesthésie adéquate.

Cependant, l’administration d’une anesthésie par cône de nez peut ne pas être possible pour tous les modèles de tubes de sablage, en particulier pour ceux dont les enceintes sont pleines et qui ne permettent pas l’insertion du tube dans la section entraînée. Dans de tels cas, des anesthésiques injectables peuvent être préférables. Nous vous recommandons de déterminer le temps nécessaire à l’administration des explosions séquentielles répétées, puis d’administrer suffisamment d’anesthésique pour maintenir l’inconscience tout au long de la procédure. Des contrôles supplémentaires du bien-être animal peuvent être nécessaires au cours de la mise au point de cette méthode modifiée pour assurer un bon maintien de l’anesthésie. De plus, l’utilisation d’injectables peut rendre impossible la surveillance postaiguë de la réponse, comme la collecte de mesures de temps de redressement.

Les considérations éthiques sont primordiales dans la recherche sur les animaux, et ce modèle de LLB en laboratoire intègre des protocoles complets de récupération et de surveillance après l’explosion. Les effets sans cruauté après l’exposition à l’explosion, y compris la difficulté à respirer, l’incapacité à se redresser, l’état non ambulatoire après une période d’observation de 2 heures, les mouvements ressemblant à des convulsions, les mouvements maladroits, les troubles de la vision et les signes d’hémorragie interne ou de membres fracturés, sont observés de près. Notamment, les souris blast LLB n’ont présenté aucune de ces conditions dans nos expériences. Cependant, des fractures des membres peuvent survenir pendant les HLB, souvent en raison d’une erreur de l’opérateur. Pour atténuer ce risque, il faut faire pivoter les mains et les pieds vers la ligne médiane de l’animal pendant l’arrimage sur la civière. Cette technique empêche le vent de souffler vers l’arrière et de briser les os associés.

Les avantages de ce modèle répétitif de LLB vont au-delà des considérations éthiques pour s’étendre aux aspects pratiques et méthodologiques. Sa conception en laboratoire élimine la nécessité de manipuler des explosifs, améliorant ainsi la sécurité et l’accessibilité. Le modèle est hautement reproductible et personnalisable, ce qui permet aux chercheurs d’influencer les paramètres d’exposition en utilisant différents types de gaz, paramètres de dispositif et forces de membrane. L’hélium, qui est choisi ici pour sa capacité à reproduire la cinétique d’explosion en champ libre49, peut fournir une référence fiable 47,59,60. L’ajustement de la pression de pointe est réalisé empiriquement en modifiant l’épaisseur ou la résistance de la membrane de rétention, ce qui permet un réglage précis pour des exigences expérimentales spécifiques. Enfin, le modèle LLB élimine l’impact des variations saisonnières ou météorologiques sur les données, l’exposition des animaux et d’autres facteurs expérimentaux. Cette cohérence garantit des résultats robustes et fiables, ce qui fait de ce modèle LLB répétitif un outil inestimable pour la recherche longitudinale et très répétitive sur les explosions.

Pour comprendre les neurotraumatismes liés aux explosions, il faut élucider les mécanismes de blessures, les mesures d’intensité des explosions et les valeurs seuils. Cependant, des incertitudes entourent les mécanismes de lésions cérébrales humaines dans les scénarios d’explosion. Les critères précédemment proposés pour les dommages causés aux humains à la suite d’une exposition à l’explosion se sont appuyés sur des études animales, mais il est difficile d’appliquer directement ces études aux humains en raison de critères d’échelle incomplets pour l’ensemble des espèces61. L’échelle des lésions pulmonaires basée sur la masse corporelle de l’animal est une exception, compte tenu de la présence de critères acceptés62,63. Les lois d’échelle proposées pour les effets cérébraux, basées sur le corps64,65 ou la masse cérébrale66, négligent toutefois les différences anatomiques connues et inconnues, en particulier en ce qui concerne les structures protectrices à l’intérieur et autour du cerveau. La mise à l’échelle de masse prédit des risques de blessures plus élevés chez les espèces de petite taille, ce qui est contredit par des études chez les oiseaux 67,68,69 et les humains 70. L’élaboration de lois d’échelle précises exige donc une compréhension empirique de la relation entre l’intensité des événements d’explosion externe et les effets cérébraux internes à travers les espèces. Dans le cas des LLB, on sait très peu de choses sur l’exposition unique ou chronique chez les modèles animaux ou chez les humains. Par conséquent, les études empiriques nécessaires pour éclairer le développement de futures lois d’échelle dans la gamme d’intensité LLB peuvent être catalysées par notre méthode.

En résumé, ce modèle de tube de choc en laboratoire représente une avancée significative dans l’étude des effets chroniques de l’exposition à la LLB chez la souris. En intégrant des procédures de modélisation des surpressions constantes, en priorisant la récupération et la surveillance après l’explosion, et en mettant en évidence des avantages distincts par rapport aux autres modèles, ce modèle de LLB en laboratoire peut constituer un choix fiable et éthique pour faire progresser notre compréhension des blessures liées à l’exposition chronique à la LLB.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JSM a reçu un financement du Bureau de la recherche et du développement en laboratoire biomédical du ministère des Anciens combattants des États-Unis (JSM, I01BX004896) et du VA Northwest Mental Illness Research Education and Clinical Center, une entité VA mandatée par le Congrès qui enquête sur les lésions cérébrales induites par les explosions et le stress post-traumatique comorbide. JSM fait état d’un financement sans rapport avec le prix de recherche translationnelle du programme de recherche sur les lésions cérébrales traumatiques et la santé psychologique de l’exercice 22 (W81XWH-22-TBIPHRPTRA, numéro de bourse HT94252310755). Les auteurs remercient Andrew Shutes-David pour son aide rédactionnelle.

Materials

Adroit Thermal Recirculating Heat Pump (120 V) Parkland Scientific HTP-1500
Copy paper, 75 g/m2 weight Staples 897804
Disposable Absorbant Blue Pads VWR 82020-845
Forane Inhalant Solution MedLine 10019-360-60
Helium Linde UN1046
Laboratory tape (1") VWR 89098-076
LabView software Emerson V 2011
Medical oxygen Central Welding Supply UN1072
Mylar, 0.005 thickness Tapp Plastics 22934
Plastic cling wrap Santa Cruz Biotechnology sc-3687
Plastic twist ties  VWR 11215-940
Pneumatic Shocktube (with driver and spool sections; target area sized for mice, 20 kHz sampling rate pressure sensors, control and acquisition software) BakerRisk, San Antonio, TX custom
Reusable Heavy Duty Heating Pad (12" x 18") Parkland Scientific 121218
Scissor-style, Rodent Ear Punch Kent Scientific INS750076-2
Sliding Top Chambers for Traditional Vaporizers Kent Scientific VetFlo-0530SM
VetFlo Isoflurane Vaporizer Kent Scientific VetFlo-1210S
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Repetitive Low-level Blast ExposureMouse ModelPneumatic Shock TubeOpen-field BlastTraumatic Brain InjuryMilitary TrainingBlast Overpressure

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Crabtree, A., McEvoy, C., Muench, P., Ivory, R. A., Rodriguez, J., Omer, M., Charles, T., Meabon, J. S. Modeling Highly Repetitive Low-level Blast Exposure in Mice. J. Vis. Exp. (207), e66592, doi:10.3791/66592 (2024).
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