Este protocolo fornece um procedimento de preparação otimizado e elaborado para amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão. É adequado para aplicações que envolvem a análise de sinapses em organoides retinianos maduros.
Os organoides retinianos (ROs) são um sistema de cultura tridimensional que imita as características da retina humana que se diferenciaram das células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) sob condições específicas. O desenvolvimento e a maturação da sinapse em ROs têm sido estudados imunocitoquímica e funcionalmente. No entanto, a evidência direta da ultraestrutura de contato sináptico é limitada, contendo sinapses de fita especiais e sinapses químicas convencionais. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) é caracterizada por alta resolução e uma história respeitável elucidando o desenvolvimento da retina e a maturação das sinapses em humanos e várias espécies. É uma ferramenta poderosa para explorar a estrutura sináptica em ROs e é amplamente utilizada no campo de pesquisa de ROs. Portanto, para explorar melhor a estrutura dos contatos sinápticos de RO em nanoescala e obter evidências microscópicas de alta qualidade, desenvolvemos um método simples e repetível de preparação de amostras de RO TEM. Este artigo descreve o protocolo, os reagentes usados e as etapas detalhadas, incluindo a preparação da fixação do RO, pós-fixação, incorporação e visualização.
A retina, um órgão sensorial visual vital em humanos e mamíferos, exibe uma estrutura laminada distinta caracterizada por três camadas nucleares que abrigam somas de neurônios e duas camadas plexiformes formadas por conexões sinápticas1, incluindo sinapses convencionais e a sinapse de fita especializada 2,3. A sinapse da fita desempenha um papel crucial na transmissão de impulsos de vesículas de maneira gradual 2,3. O processo de visão envolve a transmissão de sinais eletro-ópticos através de vários níveis de neurônios e sinapses, atingindo o córtex visual 4,5.
Os organoides retinianos (ROs) representam um sistema de cultura tridimensional (3D) derivado de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), mimetizando os estados fisiológicos do tecido retiniano in vitro 1,6,7. Essa abordagem é promissora para estudar doenças da retina8, triagem de drogas9 e servir como uma terapia potencial para condições degenerativas irreversíveis da retina, como retinite pigmentosa10 e glaucoma11. Como um poderoso sistema de condução óptica in vitro, a sinapse dentro das ROs é uma estrutura crucial que facilita a transformação e transferência efetivasdo sinal 5.
O desenvolvimento de RO pode ser dividido em três estágios de acordo com suas características morfológicas e perfis de expressão molecular 6,12. As ROs no estágio 1 (em torno de D21-D60) compreendem células progenitoras neurais da retina, muitas células ganglionares da retina (RGCs) e algumas células amácrinas starburst (SACs), correspondendo à primeira época do desenvolvimento fetal humano. No estágio 2 (em torno de D50-D150), as ROs expressam alguns precursores de fotorreceptores, interneurônios e genes relacionados à sinaptogênese, o que representa uma fase de transição. Os fotorreceptores desenvolvem maturidade no estágio 3 ROs (por volta de D100-D150), correspondendo ao terceiro estágio do desenvolvimento fetal humano 6,12,13. Notavelmente, em comparação com ROs no estágio 1 e estágio 2, os ROs no estágio 3 têm uma estrutura lamelar distinta cujas sinapses amadureceram12, incluindo a presença de sinapses de fita14. Além disso, um estudo recente confirmou que as sinapses maduras existem na transmissão de sinais luminosos, indicando que são funcionais13. Assim, os ROs no estágio 3 são frequentemente selecionados para investigar a estrutura sináptica.
A imuno-histoquímica é amplamente aplicada ao estudo da expressão de várias proteínas moleculares. No entanto, a limitação da microscopia óptica reside em sua capacidade de observar apenas um número restrito de células e moléculas específicas por vez, resultando na falta de uma análise abrangente das relações entre as células e o ambiente circundante. A Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) é caracterizada por alta resolução, com resolução limitada de 0,1-0,2 nm, superando o microscópio óptico em ~10-20 vezes15. Ele compensa os defeitos da microscopia óptica e é usado para elucidar o desenvolvimento da retina e a maturação das sinapses em humanos16,17 e várias espécies 18,19,20,21. O MET permite a distinção direta dos componentes pré-sinápticos e pós-sinápticos18,20 e até permite a observação abrangente de estruturas subcelulares, como fitas 2,3, vesículas22 e mitocôndrias23. Portanto, o MET é uma ferramenta essencial para identificar tipos de sinapses e explorar a ultraestrutura dos contatos sinápticos em ROs em nanoescala.
É crucial observar que a preparação da amostra é de grande importância para a aquisição de micrografias eletrônicas de alta qualidade. Embora alguns estudos tenham realizado ME em ROs 12,13,24, os procedimentos detalhados não são claros. Como a qualidade da imagem de microscopia eletrônica depende em grande parte do efeito da fixação do RO e da permeação do reagente, vários fatores importantes precisam ser considerados durante a preparação. Consequentemente, para melhor investigar os contatos sinápticos em ROs, apresentamos um método com boa reprodutibilidade que mostra os pontos de operação de fixação de RO, incorporação e identificação de locais de observação.
Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado para observação da ultraestrutura sináptica convencional e de fita em ROs por TEM. Esse protocolo é baseado nos métodos de preparo retiniano descritos anteriormente com algumas modificações20. Para melhorar a taxa de sucesso do tratamento da amostra e a qualidade das micrografias de MET, considere os seguintes pontos-chave. Em primeiro lugar, é importante reconhecer que as ROs se desenvolvem a partir de iPS…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2022YFA1105503), do Laboratório Estadual de Neurociência (SKLN-202103) e da Fundação de Ciências Naturais de Zhejiang da China (Y21H120019), da Fundação de Ciências Naturais da China (82070981).
100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
Acetone | Electron Microscopy Science | 10000 | |
B27 supplement | Gibco | A3582801 | |
Cell lifter | Santa Cruz | sc-395251 | |
Copper grids | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | AZH400HH | |
DigitalMicrograph Software | Gatan, Inc. | Software | |
Dispase | StemCell Technologies | #07913 | Bacterial protease |
DMEM/F12 medium | Gibco | #11320033 | |
Embedding mold | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | GZ10592 | |
Epon-812 resin | Electron Microscopy Science | #14900 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | #04-0021A | |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
hiPSC | Shownin Biotechnology Co. Ltd. | RC01001-A | |
Lead citrate | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | GZ02618 | |
L-GlutaMax | Life Technologies | #35050061 | L-glutamine substitute |
Matrigel | Corning | 356234 | |
Microscope slide | CITOTEST | 80312-3161 | |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | A component of PB/PBS |
NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | A component of PB/PBS |
Non-essential amino acids | Sigma | #M7145 | |
Optical microscope | Lab Binocular Biological Microscope | Xsz-107bnii | |
OsO4 | TED PELLA | 4008-160501 | |
Oven | Bluepard | BPG9040A | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-8 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | #15140-122 | |
Semi/ultrathin microtome | Reichert-Jung | 396649 | |
Taurine | Sigma | #T0625 | |
Toluidine blue | Sangon Biotech | E670105-0100 | |
Transmission Electron Microscopes | HITACHI | H-7500 | |
Uranyl acetate | TED PELLA | CA96049 | |
β-mercaptoethanol | Sigma | 444203 |