制备用于透射电子显微镜的视网膜类器官样品

视网膜是人类和哺乳动物的重要视觉感觉器官，表现出独特的层状结构，其特征是三个核层容纳神经元胞体和两个由突触连接形成的丛状层¹，包括常规突触和特化带状突触 ^2,3。带状突触在以分级方式传递囊泡冲动中起着至关重要的作用 ^2,3。视觉过程涉及电光信号跨不同层次的神经元和突触传输，最终到达视觉皮层 ^4,5。

视网膜类器官 （RO） 代表源自诱导多能干细胞 （iPSC） 的三维 （3D） 培养系统，在体外模拟视网膜组织的生理状态 ^1,6,7。这种方法有望用于研究视网膜疾病⁸ （retina diseases）、药物筛查⁹ （drug screening），并可作为不可逆视网膜退行性疾病（如视网膜色素变性¹⁰ 和青光眼¹¹）的潜在疗法。作为强大的体外光传导系统，RO 内的突触是促进有效信号转换和转移的关键结构⁵。

RO 发育根据其形态特征和分子表达谱大致可分为三个阶段 ^6,12。第 1 阶段 （D21-D60 左右） 的 RO 包括视网膜的神经祖细胞、许多视网膜神经节细胞 （RGC） 和一些星爆无长突细胞 （SAC），对应于人类胎儿发育的第一个时期。在第 2 阶段（D50-D150 左右），ROs 表达一些感光器前体、中间神经元和突触发生相关基因，这代表了一个过渡阶段。光感受器在第 3 阶段 RO （大约在 D100-D150 之后）发育成熟，对应于人类胎儿发育的第 3 阶段 ^6,12,13。值得注意的是，与第 1 阶段和第 2 阶段的 RO 相比，第 3 阶段的 RO 具有独特的层状结构，其突触已经成熟¹²，包括带状突触的存在¹⁴。此外，最近的一项研究证实，成熟的突触存在光信号的传递，表明它们具有功能性¹³。因此，通常选择第 3 阶段的 RO 来研究突触结构。

免疫组化广泛应用于研究各种分子蛋白的表达。然而，光学显微镜的局限性在于它一次只能观察有限数量的特定细胞和分子，导致缺乏对细胞与其周围环境之间关系的全面分析。透射电子显微镜 （TEM） 的特点是高分辨率，分辨率限制为 0.1-0.2 nm，比光学显微镜高出 ~10-20 倍¹⁵。它弥补了光学显微镜的缺陷，用于阐明人类^16,17 和各种物种 18,19,20,21 的视网膜发育和突触成熟。TEM 能够直接区分突触前和突触后成分^18,20，甚至允许全面观察亚细胞结构，如丝带 ^2,3、囊泡²² 和线粒体²³。因此，TEM 是在纳米尺度上识别突触类型和探索 RO 中突触接触超微结构的重要工具。

需要注意的是，样品制备对于获得高质量的电子显微照片非常重要。尽管一些研究对 ROs^12、13、24 进行了 EM，但详细程序尚不清楚。由于电镜图像的质量在很大程度上取决于 RO 固定和试剂渗透的效果，因此在制备过程中需要考虑各种重要因素。因此，为了更好地研究 ROs 中的突触接触，我们提出了一种具有良好重现性的方法，该方法显示了 RO 固定、嵌入和观察位点识别的操作点。