Preparação de amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão

A retina, um órgão sensorial visual vital em humanos e mamíferos, exibe uma estrutura laminada distinta caracterizada por três camadas nucleares que abrigam somas de neurônios e duas camadas plexiformes formadas por conexões sinápticas¹, incluindo sinapses convencionais e a sinapse de fita especializada ^2,3. A sinapse da fita desempenha um papel crucial na transmissão de impulsos de vesículas de maneira gradual ^2,3. O processo de visão envolve a transmissão de sinais eletro-ópticos através de vários níveis de neurônios e sinapses, atingindo o córtex visual ^4,5.

Os organoides retinianos (ROs) representam um sistema de cultura tridimensional (3D) derivado de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), mimetizando os estados fisiológicos do tecido retiniano in vitro ^1,6,7. Essa abordagem é promissora para estudar doenças da retina⁸, triagem de drogas⁹ e servir como uma terapia potencial para condições degenerativas irreversíveis da retina, como retinite pigmentosa¹⁰ e glaucoma¹¹. Como um poderoso sistema de condução óptica in vitro, a sinapse dentro das ROs é uma estrutura crucial que facilita a transformação e transferência efetivas^{do sinal 5}.

O desenvolvimento de RO pode ser dividido em três estágios de acordo com suas características morfológicas e perfis de expressão molecular ^6,12. As ROs no estágio 1 (em torno de D21-D60) compreendem células progenitoras neurais da retina, muitas células ganglionares da retina (RGCs) e algumas células amácrinas starburst (SACs), correspondendo à primeira época do desenvolvimento fetal humano. No estágio 2 (em torno de D50-D150), as ROs expressam alguns precursores de fotorreceptores, interneurônios e genes relacionados à sinaptogênese, o que representa uma fase de transição. Os fotorreceptores desenvolvem maturidade no estágio 3 ROs (por volta de D100-D150), correspondendo ao terceiro estágio do desenvolvimento fetal humano ^6,12,13. Notavelmente, em comparação com ROs no estágio 1 e estágio 2, os ROs no estágio 3 têm uma estrutura lamelar distinta cujas sinapses amadureceram¹², incluindo a presença de sinapses de fita¹⁴. Além disso, um estudo recente confirmou que as sinapses maduras existem na transmissão de sinais luminosos, indicando que são funcionais¹³. Assim, os ROs no estágio 3 são frequentemente selecionados para investigar a estrutura sináptica.

A imuno-histoquímica é amplamente aplicada ao estudo da expressão de várias proteínas moleculares. No entanto, a limitação da microscopia óptica reside em sua capacidade de observar apenas um número restrito de células e moléculas específicas por vez, resultando na falta de uma análise abrangente das relações entre as células e o ambiente circundante. A Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) é caracterizada por alta resolução, com resolução limitada de 0,1-0,2 nm, superando o microscópio óptico em ~10-20 vezes¹⁵. Ele compensa os defeitos da microscopia óptica e é usado para elucidar o desenvolvimento da retina e a maturação das sinapses em humanos^16,17 e várias espécies 18,19,20,21. O MET permite a distinção direta dos componentes pré-sinápticos e pós-sinápticos^18,20 e até permite a observação abrangente de estruturas subcelulares, como fitas ^2,3, vesículas²² e mitocôndrias²³. Portanto, o MET é uma ferramenta essencial para identificar tipos de sinapses e explorar a ultraestrutura dos contatos sinápticos em ROs em nanoescala.

É crucial observar que a preparação da amostra é de grande importância para a aquisição de micrografias eletrônicas de alta qualidade. Embora alguns estudos tenham realizado ME em ROs 12,13,24, os procedimentos detalhados não são claros. Como a qualidade da imagem de microscopia eletrônica depende em grande parte do efeito da fixação do RO e da permeação do reagente, vários fatores importantes precisam ser considerados durante a preparação. Consequentemente, para melhor investigar os contatos sinápticos em ROs, apresentamos um método com boa reprodutibilidade que mostra os pontos de operação de fixação de RO, incorporação e identificação de locais de observação.