Met behulp van splitsing onder doelen en tagmentatie (CUT&tag) assay in muizenmyoblastonderzoek
Summary
Onderzoekers die nieuw zijn in het epigenetische veld zullen CUT&Tag een aanzienlijk eenvoudiger alternatief vinden voor ChIP-tests. CUT&Tag heeft enorm geprofiteerd van de epigenetische studies op zeldzame en primaire celpopulaties, door hoogwaardige gegevens te genereren uit zeer weinig cellen. Dit protocol beschrijft het uitvoeren van H3K4me1 CUT&Tag-assays op muizenmyoblasten geïsoleerd uit de achterpotspieren van muizen.
Abstract
Dit protocoldocument is bedoeld om de nieuwe onderzoekers te voorzien van de volledige details van het gebruik van Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT & Tag) om de genomische locaties van chromatinebindingsfactoren, histonmarkeringen en histonvarianten te profileren. CUT&Tag-protocollen werken zeer goed met muizenmyoblasten en vers geïsoleerde spierstamcellen (MuSC’s). Ze kunnen gemakkelijk worden toegepast op veel andere celtypen, zolang de cellen maar kunnen worden geïmmobiliseerd door Concanovalin-A-korrels. Vergeleken met CUT&Tag zijn chromatine immunoprecipitatie (ChIP) assays tijdrovende experimenten. ChIP-assays vereisen de voorbehandeling van chromatine voordat het chromatische materiaal kan worden gebruikt voor immunoprecipitatie. Bij cross-linking ChIP (X-ChIP) omvat de voorbehandeling van chromatine crosslinking en sonicatie om het chromatine te fragmenteren. In het geval van natieve ChIP (N-ChIP) worden de gefragmenteerde chromatines normaal gesproken bereikt door microkokkennuclease (MNase) vertering. Zowel sonicatie als MNase-digestie introduceren enige vertekening in de ChIP-experimenten. CUT&Tag-assays kunnen in minder stappen worden voltooid en vereisen veel minder cellen in vergelijking met ChIP’s, maar bieden meer onbevooroordeelde informatie over transcriptiefactoren of histonmarkeringen op verschillende genomische locaties. CUT&Tag kan al met 5.000 cellen functioneren. Vanwege de hogere gevoeligheid en het lagere achtergrondsignaal dan ChIP’s, kunnen onderzoekers verwachten betrouwbare piekgegevens te verkrijgen van slechts enkele miljoenen lezingen na sequencing.
Introduction
De CUT&Tag-test is uitgevonden om enkele openlijke tekortkomingen van ChIPs1 te compenseren. De twee grote nadelen van ChIP’s zijn 1) de bias die optreedt bij het fragmenteren van chromatine en 2) de incompetentie om met lage celaantallen te werken. X-ChIP-assays zijn gebaseerd op sonicatie of MNase-vertering om chromatinefragmenten te krijgen, terwijl N-ChIP meestal MNase-vertering gebruikt om nucleosomen te krijgen. Sonicatie vertoont een voorkeur voor ontspannen chromatinelocaties zoals promotorregio’s2, en blijkbaar werkt MNase-vertering ook efficiënter op ontspannen chromatinevezels. Bovendien meldden sommigen dat MNase-digestie ook een DNA-sequentie-afhankelijke bias vertoont3. Daarom is het bij de invoervoorbereidingsstap van ChIP-assays onmogelijk om op een perfect willekeurige manier chromatinefragmenten van allerlei genomische locaties te krijgen. Bovendien genereren ChIP-assays normaal gesproken hogere achtergrondsignalen in vergelijking met CUT&Tag en vereisen ze meer dan 10 keer meer lezingen dan CUT&Tag om te accentueren waar de pieken 1,4,5 zijn. Dit verklaart waarom ChIP-experimenten met veel meer cellen moeten beginnen dan CUT&Tag. Dit is geen probleem bij het bestuderen van cellijnen, omdat ze herhaaldelijk kunnen worden gepasseerd om een zeer hoog celaantal te bereiken. De ChIP-test is echter zeker geen sterk epigenetisch hulpmiddel om zeldzame of kostbare primaire celpopulaties te bestuderen, hoewel primaire cellen uiteraard meer praktische en medische implicaties hebben.
Hoewel de lange en gecompliceerde ChIP-procedure sommige onderzoekers ontmoedigt om deze techniek te leren of te gebruiken, voelen mensen zich meer op hun gemak bij eenvoudigere tests zoals immunocytochemie (ICC) of immunofluorescentie (IF). Een CUT&Tag-test lijkt in wezen op het proces van ICC- en IF-experimenten, maar vindt alleen plaats in een reageerbuis. CUT&Tag heeft om te beginnen geen gefragmenteerd chromatine nodig, en in plaats daarvan moet het genoom intact zijn voor antilichaambinding1. Op de eerste dag van een ChIP-experiment besteden onderzoekers normaal gesproken tot 4 uur aan het voorbereiden van de gefragmenteerde chromatines uit kernen met sonicatie of MNase-digestie voordat de korte chromatinestukjes kunnen worden gemengd met antilichaamkralen 4,5. In opmerkelijk contrast hiermee is de werklast op de eerste dag van een CUT&Tag-procedure om de cellen gewoon te immobiliseren tot Concanavalin-A-korrels en vervolgens het primaire antilichaam aan de celkorrels toe te voegen. Dit vereist slechts ~40 min1.
Het is vermeldenswaard dat Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT&RUN) een belangrijk alternatief is voor CUT&Tag. CUT&RUN is opgericht op basis van een vergelijkbaar werkingsmechanisme als CUT&Tag. In CUT&Tag leiden de antilichamen de pA/G-Tn5-transposase naar alle locaties waar het enzym elk een stukje chromatine zal wegknippen en het ondertussen zal labelen met bibliotheekmakende adapters, terwijl in CUT&RUN de rol van pA/G-Tn5 wordt gespeeld door het pA/G-MNase dat alleen het knipgedeelte van het werk uitvoert6. Daarom vereist CUT&RUN, in vergelijking met CUT&Tag, een extra stap, namelijk het lijmen van de bibliotheekmakende adapters op de pA/G-MNase-gefragmenteerde DNA-stukjes 7,8. Door de grote overeenkomsten tussen CUT&Tag en CUT&RUN zullen onderzoekers die bekend zijn met CUT&Tag zich gemakkelijk aanpassen aan het vakkundig uitvoeren van CUT&RUN. Er moet echter worden opgemerkt dat er enkele kleine verschillen bestaan tussen CUT&Tag en CUT&RUN. CUT&RUN-protocollen gebruiken normaal gesproken de fysische zoutconcentratie (~150 mM) in de wasstappen, terwijl in CUT&Tag de 300-Dig wasbuffer veel zout bevat. Daarom is CUT&Tag goed in het beheersen van de achtergrond bij het profileren van histonmarkeringen/-varianten of transcriptiefactoren, omdat deze eiwitten direct en sterk DNAbinden 1. CUT&Tag kan problemen ondervinden bij het profileren van chromatine-geassocieerde factoren die niet direct DNA binden en een zwakke affiniteit met het chromatine vertonen. Stappen met een hoog zoutgehalte in CUT&Tag kunnen chromatine-geassocieerde factoren verwijderen en geen signalen veroorzaken in de uiteindelijke output. Hoewel er succesvolle gevallen zijn waarin CUT&Tag kan worden gebruikt om sommige niet-histon/niet-transcriptiefactoreiwitten9 te profileren, raden we toch CUT&RUN aan via CUT&Tag om zwak gebonden chromatine-geassocieerde eiwitten te profileren.
Nadat zoogdieren de volwassenheid hebben bereikt, bevatten hun skeletspierweefsels nog steeds spierstamcellen. Tijdens spierletsel kunnen deze stamcellen worden geactiveerd en celnummeruitbreiding en differentiatie ondergaan om beschadigde spiervezels te regenereren10. Deze stamcellen staan bekend als spierstam-/satellietcellen (MuSC’s). Nadat MuSC’s zijn geïsoleerd van dieren of eenmaal zijn geactiveerd door spierletsel, beginnen ze zich te vermenigvuldigen en worden ze myoblasten.
Om MuSC’s te verkrijgen uit de skeletspierdigestie van muizen, worden MuSC-oppervlaktemarkers zoals Vcam1 (Cd106), Cd34 en α7-integrine (Itga7) vaak afzonderlijk of in combinaties gebruikt om MuSC’s te verrijken tijdens fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)11. Het is aangetoond dat Cd31–/Cd45–/Sca1–/Vcam1+ waarschijnlijk de beste markercombinatie is om >95% zuivere MuSCs12 te krijgen. FACS kan pure MuSC’s isoleren direct nadat verse spieren zijn verteerd. Als het experimentele ontwerp echter geen zuivere MuSC’s vereist direct bij hun isolatie, is pre-plating kosteneffectiever dan FACS om >90% zuivere myoblasten (MuSC-nageslacht) te verkrijgen.
MuSC’s die vers uit muizen zijn geïsoleerd, prolifereren niet efficiënt in Ham’s F10-media aangevuld met foetaal runderserum (FBS). Om het celaantal MuSC’s beter uit te breiden en voldoende myoblasten te krijgen, moet rundergroeiserum (BGS) worden gebruikt in plaats van FBS. Als BGS echter niet beschikbaar is, kan Ham’s F10 volledige media (bestaande uit ongeveer 20% FBS) worden gemengd met een gelijk volume T-cel conditionele media om myoblastexpansie dramatisch te bevorderen13. Daarom zal dit protocol ook de bereiding van T-cel media geconditioneerde MuSC media beschrijven.
Het belangrijkste is dat dit protocol een compleet voorbeeld biedt van het uitvoeren van H3K4me1 CUT&Tag-assays op muizenmyoblasten geïsoleerd uit de achterpotspieren van muizen. Houd er rekening mee dat dit protocol ook van toepassing is op andere celtypen en histonmarkeringen en histonvarianten, en dat lezers alleen het aantal cellen of de hoeveelheden antilichamen voor hun gevallen hoeven te optimaliseren op basis van de verrijking van de specifieke histonmarkeringen of varianten die ze bestuderen.
Om te worden gebruikt in CUT&Tag of CUT&RUN, moet het Tn5 of MNase worden gefuseerd met eiwit A of eiwit G om pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase of pG-MNase te maken. Blijkbaar kunnen zowel eiwit A als eiwit G tegelijkertijd op deze enzymen worden gefuseerd om pA/G-Tn5 of pA/G-MNase te genereren. Eiwit A en proteïne G vertonen differentiële affiniteiten met IgG’s van verschillende soorten. Daarom kan het samensmelten van eiwit A en eiwit G op het enzym dit probleem oplossen en het enzym compatibel maken met antilichamen van meerdere soorten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het specifieke celnummer dat nodig is voor een bepaalde CUT&Tag-reactie is volledig afhankelijk van de verrijking van de histonmarkeringen/varianten of chromatinebindende eiwitten die moeten worden getest. Normaal gesproken zijn voor zeer verrijkte histonmarkeringen zoals H3K4me1, H3K4me3 en H3K27ac enz. 25.000-50.000 myoblasten voldoende voor één CUT&Tag-reactie. Voor sommige zeldzame chromatinebindende eiwitten kunnen echter tot 250.000 cellen nodig zijn. Het celnummer dat wordt gebruikt in CUT&Tag-assays is van cruc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Strategic Priority Research Program van de Chinese Academie van Wetenschappen (XDA16020400 tot PH); de National Natural Science Foundation of China (32170804 tot PH).
Materials
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004177 | |
| Concanavalin-A | Sigma-Aldrich | C5275 | |
| Concanavalin-A beads | Bangs Laboratories | BP531 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 300410 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| H3K4me1 antibody | abcam | ab8895 | |
| Ham's F10 media | Thermo Fisher Scientific | 11550043 | |
| Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina | Vazyme | TD903 | This kit has been tested by us to function well |
| Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes | Qualityard | QYM06 | |
| Magnetic rack for 8-PCR tube stripes | Anosun Magnetic | CLJ16/21-021 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | NEB | M0541L | For library-making PCR reaction |
| pA-Tn5 | Vazyme | S603-01 | Needs to be mounted with adaptors before use |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| Proteinase K | Beyotime | ST535-100mg | |
| RPMI-1640 media | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG) | Antibodies-online | ABIN101961 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | |
| TruePrep Index Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD202 | This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers |
| VAHTS DNA Clean Beads | Vazyme | N411 | Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size |
Referências
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930 (2019).
- Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating high-resolution maps of genome-wide protein binding. eLife. 4, e09225 (2015).
- Nikitina, T., Wang, D., Gomberg, M., Grigoryev, S. A., Zhurkin, V. B. Combined micrococcal nuclease and exonuclease III digestion reveals precise positions of the nucleosome core/linker junctions: implications for high-resolution nucleosome mapping. J Mol Biol. 425 (11), 1946-1960 (2013).
- Policastro, R. A., Zentner, G. E. Enzymatic methods for genome-wide profiling of protein binding sites. Brief Funct Genomics. 17 (2), 138-145 (2018).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, e21856 (2017).
- Mezger, A., et al. High-throughput chromatin accessibility profiling at single-cell resolution. Nat Commun. 9, 3647 (2018).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 8, 14049 (2017).
- Nakka, K., et al. JMJD3 activated hyaluronan synthesis drives muscle regeneration in an inflammatory environment. Science. 377 (6606), 666-669 (2022).
- Fu, X., Wang, H., Hu, P. Stem cell activation in skeletal muscle regeneration. Cell Mol Life Sci. 72 (9), 1663-1677 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skelet Muscle. 6, 35 (2016).
- Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Mol Cell. 74 (3), 609-621.e6 (2019).
- Fu, X., et al. Combination of inflammation-related cytokines promotes long-term muscle stem cell expansion. Cell Res. 25 (6), 655-673 (2015).
- Li, Y., et al. Chromatin and transcription factor profiling in rare stem cell populations using CUT&Tag. STAR Protoc. 2 (3), 100751 (2021).
- Tapscott, S. J., Davis, R. L., Lassar, A. B., Weintraub, H. MyoD: a regulatory gene of skeletal myogenesis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 280, 3-6 (1990).
- Wardle, F. C. Master control: transcriptional regulation of mammalian Myod. J Muscle Res Cell Motil. 40 (2), 211-226 (2019).
- Local, A., et al. Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers. Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Faralli, H., et al. UTX demethylase activity is required for satellite cell-mediated muscle regeneration. J Clin Invest. 126 (4), 1555-1565 (2016).
- Yang, J. H., et al. Myogenic transcriptional activation of MyoD mediated by replication-independent histone deposition. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 85-90 (2011).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).
