Nachweis und Quantifizierung von Mono-Rhamnolipiden und Di-Rhamnolipiden, die von Pseudomonas aeruginosa produziert werden

Pseudomonas aeruginosa ist ein Umweltbakterium und ein opportunistischer Krankheitserreger, der aufgrund seiner Produktion von Virulenz-assoziierten Merkmalen und seiner hohen Antibiotikaresistenz sehr besorgniserregend^{ist 1,2}. Ein charakteristischer Sekundärmetabolit, der von diesem Bakterium produziert wird, ist das Biotensid RL, das in koordinierter Weise mit mehreren Virulenz-assoziierten Merkmalen wie dem Phenazin Pyocyanin, einem Antibiotikum mit Redoxaktivität, und der Protease Elastase³ hergestellt wird. Die tensioaktiven und emulgierenden Eigenschaften von RL wurden in verschiedenen industriellen Anwendungen genutzt und werden derzeit kommerzialisiert⁴.

Die meisten P. aeruginosa-Stämme, die zu den Phylogruppen 1 und 2 gehören, produzieren zwei Arten von RL: mRL, das aus einer Rhamnose-Einheit besteht, die mit einem Fettsäuredimer verbunden ist, das hauptsächlich aus 10 Kohlenstoffatomen besteht, und dRL, das eine zusätzliche Rhamnose-Einheit enthält, die mit der ersten Rhamnose⁴ verbunden ist (siehe Abbildung 1). Es wurde jedoch berichtet, dass zwei kleinere P. aeruginosa-Phylogruppen (Gruppen 3 und 5) nur mRL ^5,6 produzieren. Die beiden Arten von RL enthalten ein Gemisch von Fettsäuredimeren, die, wie erwähnt, hauptsächlich C10-C10 sind, aber es werden auch kleinere Anteile von Molekülen hergestellt, die C12-C10-, C12-C12- und C10-C12:1-Dimere enthalten. Die Charakterisierung der RL-Kongenere, die von verschiedenen Stämmen unter Verwendung von HPLC MS/MS produziert werden, wurde berichtet ^7,8. Die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden können nur zwischen mRL und dRL unterscheiden, können aber nicht für die Charakterisierung der RL-Kongenere verwendet werden.

P. aeruginosa und einige Burkholderia-Arten sind natürliche Produzenten von RL⁹, aber das erstgenannte Bakterium ist der effizienteste Produzent. Kommerziell genutztes RL wird jedoch derzeit in Pseudomonas putida KT2440-Derivaten hergestellt, die P. aeruginosa-Gene exprimieren, um die Verwendung dieses opportunistischen Erregers zu vermeiden^10,11. Der Nachweis und die Quantifizierung von RL, die von P. aeruginosa produziert werden, sind von großer Bedeutung für die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die an der Ausprägung von Virulenzmerkmalen beteiligt sind¹², für die Charakterisierung von Stämmen, die zu den Kladen 3 oder 5¹³ gehören, und für die Konstruktion von P. aeruginosa-Derivaten, die diese Biotenside überproduzieren und gleichzeitig eine verminderte Virulenz aufweisen¹⁴. Die Produktion von Biotensiden durch verschiedene Mikroorganismen wurde auf der Grundlage einiger allgemeiner Eigenschaften dieser Verbindungen, wie z. B. der Kollapstropfenmethode oder des Emulgierungsindex¹⁵, nachgewiesen, aber diese Methoden sind weder genau noch spezifisch¹⁶.

In dieser Arbeit beschreiben wir das Protokoll zum Nachweis von mRL und dRL durch die flüssige Extraktion von Gesamt-RL aus den Kulturüberständen verschiedener P. aeruginosa-Typ-Stämme und die Trennung beider RL-Typen mittels DC. Bei diesem Verfahren werden die aus dem Kulturüberstand extrahierten RL durch ihre unterschiedliche Löslichkeit in den für die DC-Behandlung verwendeten Lösungsmitteln getrennt, was zu einer differentiellen Migration auf der Kieselgelplatte führt. Daher haben mRL eine schnellere Migration als dRL und können als separate Flecken nachgewiesen werden, wenn die Platten getrocknet und mit α-Naphthol gefärbt werden.

Das hier beschriebene Verfahren zum Nachweis von mRL und dRL mittels TLC basiert auf einem bereits veröffentlichten Artikel¹⁷, der einfach durchzuführen ist und keine teure Ausrüstung erfordert. Diese Methode hat sich als nützlich für den Nachweis von RL in verschiedenen P. aeruginosa-Isolaten ¹³ unter Verwendung geeigneter Kontrollen erwiesen, wie z. B. einer von P. aeruginosa abgeleiteten Mutante, die nicht in der Lage ist, RL zu produzieren. Aufgrund ihrer mangelnden Spezifität ist sie jedoch nicht die bevorzugte Methode zur Charakterisierung neuartiger Biotenside, die von anderen Bakterien als Pseudomonas aeruginosa produziert werden.

Darüber hinaus wird eine Methode zur Quantifizierung der Rhamnose-Äquivalente der Gesamt-RL vorgestellt, die aus einem Überstand der P . aeruginosa-Kultur extrahiert wurde. Diese Methode quantifiziert diese Biotenside auf der Grundlage der Reaktion von Orcinol mit reduktiven Zuckern, was zu einem Produkt führt, das spektrophotometrisch bei 421 nm gemessen werden kann, wie zuvor beschrieben¹⁸. Da die Reaktion mit Orcinol nicht spezifisch für Rhamnose ist, ist es wichtig, diese Methode mit RL durchzuführen, das aus dem Kulturüberstand extrahiert wurde, der keine signifikanten Mengen anderer zuckerhaltiger Moleküle wie Lipopolysaccharide (LPS) enthält. Für die flüssige Extraktion von RL¹⁸ wird hier ein angesäuertes Chloroform/Methanol-Gemisch verwendet, aber auch Ethylacetat kann verwendet werden, und die Festphasenextraktion (SPE) liefert sehr gute Ergebnisse¹⁹. Die hier beschriebene Orcin-Methode erfordert keine ausgeklügelte Ausrüstung und kann zuverlässige Ergebnisse liefern, wenn sie, wie besprochen, bei der Vorbereitung der analysierten Proben mit besonderer Sorgfalt durchgeführt wird. Um eine ordnungsgemäße Probenvorbereitung zu gewährleisten, ist es wichtig, eine Pseudomonas aeruginosa rhlA-Mutante einzubeziehen, die nicht in der Lage ist, RL²⁰ zu produzieren, und für jede Bestimmung drei biologische und drei technische Replikationen durchzuführen.

In der Literatur^16,21 gab es erhebliche Kontroversen über die RL-Bestimmung mit der Orcin-Methode, wobei einige Studien darauf hindeuten, dass die RL-Produktion überschätzt wird und dass es dem Assay an Spezifität für Rhamnose mangelt, was möglicherweise zum Nachweis anderer Zucker führt. Wir zeigen hier jedoch, dass die beschriebenen Methoden unter den entsprechenden Bedingungen genau und spezifisch sein können. Darüber hinaus verwenden wir zum Vergleich mit den in diesem Artikel beschriebenen Verfahren die UPLC-MS/MS-Detektion eines dRL-Standards und zeigen, dass mit der Orcinol-Methode ähnliche Ergebnisse erzielt werden. Das detaillierte Protokoll zur Quantifizierung der RL mit dieser Methode ist in der Zusatzdatei 1 enthalten.

Diese Protokolle werden am Beispiel der Typstämme PAO1 (Phylogruppe 1), PA14 (Phylogruppe 2) und PA7 (Phylogruppe 3) veranschaulicht. Diese Stämme wurden ausgewählt, weil sie gut charakterisiert sind und unterschiedliche RL-Profile erzeugen.