Pseudomonas aeruginosa Tarafından Üretilen Mono-Ramnolipidlerin ve Di-Ramnolipidlerin Tespiti ve Miktarının Belirlenmesi

Pseudomonas aeruginosa, virülansla ilişkili özelliklerin üretilmesi ve yüksek antibiyotik direnci ^1,2 nedeniyle çevresel bir bakteri ve büyük endişe kaynağı olan fırsatçı bir patojendir. Bu bakteri tarafından üretilen karakteristik bir ikincil metabolit, redoks aktivitesine sahip bir antibiyotik olan fenazin piyosiyanin ve proteaz^{elastaz 3} gibi virülansla ilişkili çeşitli özelliklerle koordineli bir şekilde üretilen biyosürfaktan RL’dir. RL’nin tensio-aktif ve emülsifikasyon özellikleri farklı endüstriyel uygulamalarda kullanılmıştır ve şu anda ticarileştirilmiştir⁴.

Filogrup 1 ve 2’ye ait çoğu P. aeruginosa suşları, iki tip RL üretir: mRL, esas olarak 10 karbonlu bir yağ asidi dimerine bağlı bir ramnoz parçasından oluşur ve dRL, ilk ramnoz^4’e bağlı ek bir ramnoz parçası içerir (bkz. Şekil 1). Bununla birlikte, iki minör P. aeruginosa filogrubunun (grup 3 ve 5) sadece mRL ^5,6 ürettiği bildirilmiştir. İki tip RL, belirtildiği gibi, esas olarak C10-C10 olan bir yağ asidi dimer karışımı içerir, ancak C12-C10, C12-C12 ve C10-C12: 1 dimerleri içeren daha küçük oranlarda moleküller de üretilir. HPLC MS/MS kullanılarak farklı suşlar tarafından üretilen RL türdeşlerinin karakterizasyonu bildirilmiştir ^7,8. Bu çalışmada açıklanan yöntemler yalnızca mRL ve dRL arasında ayrım yapabilir, ancak RL türdeşlerinin karakterizasyonu için kullanılamaz.

P. aeruginosa ve bazı Burkholderia türleri, RL^9’un doğal üreticileridir, ancak eski bakteri en verimli üreticidir. Bununla birlikte, ticari olarak kullanılan RL şu anda bu fırsatçı patojenin kullanımından kaçınmak için P. aeruginosa genlerini eksprese eden Pseudomonas putida KT2440 türevlerinde üretilmektedir^10,11. P. aeruginosa tarafından üretilen RL’nin tespiti ve miktarının belirlenmesi, virülansla ilgili özelliklerin¹² ekspresyonunda, 3 veya 5¹³ numaralı sınıflara ait suşların karakterizasyonunda yer alan moleküler mekanizmaların incelenmesi ve virülansı azaltırken bu biyosürfaktanları aşırı üreten P. aeruginosa türevlerinin oluşturulması için büyük önem taşımaktadır¹⁴. Biyoyüzey aktif maddelerin farklı mikroorganizmalar tarafından üretimi, bu bileşiklerin çökme damlası yöntemi veya emülsifikasyon indeksi¹⁵ gibi bazı genel özelliklerine dayalı olarak tespit edilmiştir, ancak bu yöntemler ne doğru ne de spesifik^{değildir 16}.

Burada, farklı P. aeruginosa tipi suşların kültür süpernatantlarından toplam RL’nin sıvı ekstraksiyonunu ve TLC kullanılarak her iki RL tipinin ayrılmasını kullanarak mRL ve dRL’yi tespit etmek için protokolü açıklıyoruz. Bu yöntemde, kültür süpernatından ekstrakte edilen RL, TLC için kullanılan çözücülerdeki diferansiyel çözünürlükleri ile ayrılır ve silika jel plakası üzerinde diferansiyel migrasyona neden olur. Bu nedenle, mRL, dRL’den daha hızlı bir migrasyona sahiptir ve plakalar kurutulduğunda ve α-naftol ile boyandığında ayrı noktalar olarak tespit edilebilirler.

TLC ile mRL ve dRL’yi tespit etmek için burada açıklanan yöntem, daha önce yayınlanmış, gerçekleştirilmesi kolay ve pahalı ekipman gerektirmeyen bir makale^17’ye dayanmaktadır. Bu yöntem, RL üretemeyen bir P. aeruginosa türevi mutant gibi uygun kontroller kullanılarak çeşitli P. aeruginosa izolatlarında¹³ RL’yi tespit etmek için yararlı olmuştur. Bununla birlikte, özgüllük eksikliği nedeniyle Pseudomonas aeruginosa dışındaki bakteriler tarafından üretilen yeni biyoyüzey aktif maddeleri karakterize etmek için tercih edilen yöntem değildir.

Ek olarak, bir P. aeruginosa kültür süpernatantından ekstrakte edilen toplam RL’nin ramnoz eşdeğerlerini ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem, orsinolün indirgeyici şekerlerle reaksiyonuna dayalı olarak bu biyoyüzey aktif maddelerin miktarını belirler ve daha önce açıklandığı gibi 421 nm’de spektrofotometrik olarak ölçülebilen bir ürünle^{sonuçlanır 18}. Orsinol ile reaksiyon ramnoza özgü olmadığından, bu yöntemin, lipopolisakkaritler (LPS) gibi önemli miktarda diğer şeker içeren molekülleri içermeyen kültür süpernatantından ekstrakte edilen RL ile gerçekleştirilmesi önemlidir. Burada RL^18’in sıvı ekstraksiyonu için asitleştirilmiş bir kloroform / metanol karışımı kullanılır, ancak etil asetat da kullanılabilir ve katı faz ekstraksiyonu (SPE) çok iyi sonuçlar verir¹⁹. Burada açıklanan orsinol yöntemi, karmaşık ekipman gerektirmez ve tartışıldığı gibi, analiz edilen numunelerin hazırlanmasında özel bir dikkatle gerçekleştirilirse güvenilir sonuçlar sağlayabilir. Uygun numune hazırlığını sağlamak için, RL²⁰ üretemeyen bir Pseudomonas aeruginosa rhlA mutantının dahil edilmesi ve her belirleme için üç biyolojik ve üç teknik kopya gerçekleştirilmesi önemlidir.

Literatürde^16,21 orsinol yöntemi ile RL tayini ile ilgili önemli tartışmalar olmuştur, bazı çalışmalar RL üretiminin fazla tahmin edildiğini ve testin ramnoz için özgüllükten yoksun olduğunu ve potansiyel olarak diğer şekerleri tespit ettiğini öne sürmektedir. Bununla birlikte, burada açıklanan yöntemlerin uygun koşullar altında doğru ve spesifik olabileceğini gösteriyoruz. Ayrıca, bu makalede özetlenen prosedürlerle karşılaştırma için, bir dRL standardının UPLC-MS/MS tespitini kullanıyoruz ve orsinol yöntemiyle benzer sonuçların elde edildiğini gösteriyoruz. Bu yöntemi kullanarak RL’yi ölçmek için ayrıntılı protokol Ek Dosya 1’de yer almaktadır.

Bu protokoller, PAO1 (filogrup 1), PA14 (filogrup 2) ve PA7 (filogrup 3) tip suşları kullanılarak örneklendirilir. Bu suşlar, iyi karakterize edildikleri ve farklı RL profilleri ürettikleri için seçilmiştir.