Обнаружение и количественное определение моно-рамнолипидов и ди-рамнолипидов, продуцируемых Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa является экологической бактерией и условно-патогенным микроорганизмом, вызывающим серьезную озабоченность из-за наличия у нее признаков, связанных с вирулентностью, и высокой устойчивости к антибиотикам ^1,2. Характерным вторичным метаболитом, продуцируемым этой бактерией, является биосурфактант RL, который вырабатывается скоординированным образом с несколькими признаками, связанными с вирулентностью, такими как пиоцианин феназин, антибиотик с окислительно-восстановительной активностью, и протеаза эластаза³. Тензиоактивные и эмульгирующие свойства RL были использованы в различных промышленных приложениях и в настоящее время коммерциализируются⁴.

Большинство штаммов P. aeruginosa, принадлежащих к филогруппам 1 и 2, продуцируют два типа RL: mRL, который состоит из одной группы рамнозы, связанной с димером жирных кислот, в основном состоящим из 10 атомов углерода, и dRL, который содержит дополнительную группу рамнозы, связанную с первой рамнозой⁴ (см. рис. 1). Тем не менее, сообщалось, что две второстепенные филогруппы P. aeruginosa (группы 3 и 5) продуцируют только mRL ^5,6. Эти два типа RL содержат смесь димеров жирных кислот, которые, как уже упоминалось, в основном представляют собой C10-C10, но также образуются меньшие доли молекул, содержащих димеры C12-C10, C12-C12 и C10-C12:1. ^{Сообщается о} характеристике конгенеров RL, продуцируемых различными штаммами с использованием ВЭЖХ, МС/МС ^7,8. Методы, описанные в данной работе, позволяют дифференцировать только mRL и dRL, но не могут быть использованы для характеристики родственных соединений RL.

P. aeruginosa и некоторые виды Burkholderia являются естественными продуцентами RL⁹, но первая бактерия является наиболее эффективным продуцентом. Тем не менее, коммерчески используемый RL в настоящее время продуцируется в производных Pseudomonas putida KT2440, экспрессирующих гены P. aeruginosa, чтобы избежать использования этого условно-патогенного микроорганизма^10,11. Обнаружение и количественное определение RL, продуцируемого P. aeruginosa, имеет большое значение для изучения молекулярных механизмов, участвующих в экспрессии признаков, связанных с вирулентностью12, в характеристике штаммов, принадлежащих к кладам 3 или 5,¹³, и для конструирования производных P. aeruginosa, которые в избытке продуцируют эти биоповерхностно-активные вещества, обладая при этом сниженной вирулентностью14. Производство биоповерхностно-активных веществ различными микроорганизмами было обнаружено на основе некоторых общих характеристик этих соединений, таких как метод капли коллапса или индекс эмульгирования¹⁵, но эти методы не являются ни точными, ни специфичными16.

В данной работе мы описываем протокол детектирования mRL и dRL с использованием жидкостной экстракции общего RL из супернатантов культур различных штаммов типа P. aeruginosa и разделения обоих типов RL с помощью TLC. В этом методе RL, выделенные из надосадочной жидкости культуры, разделяются по их дифференциальной растворимости в растворителях, используемых для TLC, вызывая дифференциальную миграцию на силикагелевой пластине. Таким образом, мРЛ имеют более быструю миграцию, чем дРЛ, и могут быть обнаружены как отдельные пятна при высыхании пластин и окрашивании α-нафтолом.

Описанный здесь метод выявления mRL и dRL методом TLC основан на ранее опубликованной статье¹⁷, который прост в исполнении и не требует дорогостоящего оборудования. Этот метод оказался полезным для обнаружения ЛЛ в различных изолятах 13 P. aeruginosa с использованием соответствующего контроля, такого как мутант, полученный из P. aeruginosa, неспособный продуцировать РЛ. Тем не менее, это не является предпочтительным методом для характеристики новых биоповерхностно-активных веществ, продуцируемых бактериями, отличными от Pseudomonas aeruginosa, из-за их недостаточной специфичности.

Кроме того, представлен метод количественной оценки рамнозных эквивалентов общего RL, экстрагированного из надосадочной жидкости культуры P. aeruginosa . Этот метод количественно определяет эти биоповерхностно-активные вещества на основе реакции орцина с восстановительными сахарами, в результате чего получается продукт, который может быть измерен спектрофотометрически при длине волны 421 нм, как описано ранее¹⁸. Поскольку реакция с орцинолом не является специфичной для рамнозы, важно выполнять этот метод с RL, экстрагированным из надосадочной жидкости культуры, которая не содержит значительных количеств других сахарсодержащих молекул, таких как липополисахариды (ЛПС). Для жидкой экстракции RL¹⁸ здесь используется подкисленная смесь хлороформа/метанола, но также можно использовать этилацетат, а твердофазная экстракция (SPE) дает очень^{хорошие результаты.} Описанный здесь метод орцина не требует сложного оборудования и может обеспечить надежные результаты, если его применять с особой тщательностью при подготовке анализируемых образцов, как уже говорилось. Чтобы обеспечить надлежащую подготовку образца, важно включить мутант Pseudomonas aeruginosa rhlA , неспособный продуцировать RL²⁰ , и выполнить три биологические и три технические репликации для каждого определения.

В литературе^16,21 существуют значительные разногласия относительно определения RL методом орцинола, при этом некоторые исследования предполагают, что продукция RL завышена и что анализу не хватает специфичности для рамнозы, что потенциально обнаруживает другие сахара. Тем не менее, мы демонстрируем здесь, что описанные методы могут быть точными и специфичными при соответствующих условиях. Кроме того, для сравнения с процедурами, описанными в этой статье, мы используем UPLC-MS/MS обнаружение стандарта dRL и демонстрируем, что аналогичные результаты получены с помощью метода орцина. Подробный протокол количественного определения RL с использованием этого метода включен в Дополнительный файл 1.

Эти протоколы иллюстрируются типовыми штаммами PAO1 (филогруппа 1), PA14 (филогруппа 2) и PA7 (филогруппа 3). Эти штаммы были выбраны потому, что они хорошо охарактеризованы и продуцируют различные профили RL.