铜绿假单胞菌产生的单鼠李糖脂和二鼠李糖脂的检测和定量

铜绿假单胞菌是一种环境细菌，也是一种机会性病原体，由于其产生毒力相关特征和高度抗生素耐药性而备受关注 ^1,2。这种细菌产生的特征性次生代谢物是生物表面活性剂 RL，它与几种毒力相关性状（如奋人静绿脓素，一种具有氧化还原活性的抗生素）和蛋白酶弹性蛋白酶³ 以协调方式产生。RL 的拉伸活性和乳化特性已在不同的工业应用中得到开发，目前已商业化⁴。

大多数铜绿假单胞菌菌株属于系统群 1 和 2，产生两种类型的 RL：mRL，它由一个鼠李糖部分组成，该部分与主要由 10 个碳组成的脂肪酸二聚体相连，以及 dRL，它包含一个与第一个鼠李糖⁴ 相连的额外鼠李糖部分（见图 1）。然而，据报道，两个次要铜绿假单胞菌系统群（第 3 组和第 5 组）仅产生 mRL ^5,6。两种类型的 RL 包含脂肪酸二聚体的混合物，如前所述，主要是 C10-C10，但也会产生较小比例的含有 C12-C10、C12-C12 和 C10-C12：1 二聚体的分子。已经报道了使用 HPLC MS/MS 对不同菌株产生的 RL 同系物的表征 ^7,8。这项工作中描述的方法只能区分 mRL 和 dRL，而不能用于表征 RL 同系物。

铜绿假单胞菌和一些伯克霍尔德菌属是 RL⁹ 的天然生产者，但前者细菌是最有效的生产者。然而，目前商业上使用的 RL 是在表达铜绿假单胞菌基因的恶臭假单胞菌 KT2440 衍生物中产生的，以避免使用这种机会性病原体^10,11。铜绿假单胞菌产生的 RL 的检测和定量对于研究毒力相关性状表达所涉及的分子机制¹²、属于分支 3 或 5 的菌株的表征¹³ 以及构建过度产生这些生物表面活性剂同时具有降低毒力的铜绿假单胞菌衍生物¹⁴ 具有重要意义.已根据这些化合物的一些一般特性（例如塌陷滴法或乳化指数¹⁵）来检测不同微生物生产生物表面活性剂的情况，但这些方法既不准确也不具体¹⁶。

在这里，我们描述了使用从不同 铜绿假单胞菌型菌株的培养上清液中液体提取总 RL 来检测 mRL 和 dRL 的方案，以及使用 TLC 分离两种类型的 RL。在这种方法中，从培养上清液中提取的 RL 通过它们在用于 TLC 的溶剂中的溶解度差异进行分离，从而导致硅胶板上的差异迁移。因此，mRL 比 dRL 具有更快的迁移速度，并且在板干燥并用 α-萘酚染色时，它们可以被检测为单独的点。

此处描述的通过 TLC 检测 mRL 和 dRL 的方法基于先前发表的第¹⁷ 篇文章，该方法易于执行且不需要昂贵的设备。该方法可用于使用适当的对照检测各种 铜绿假单 胞菌分离株¹³ 中的 RL，例如无法产生 RL 的铜 绿假单胞菌衍生突变体。然而，由于缺乏特异性，它不是表征 铜绿假单胞 菌以外的细菌产生的新型生物表面活性剂的首选方法。

此外，还提出了一种定量从铜绿假单胞菌培养上清液中提取的总 RL 的鼠李糖当量的方法。该方法根据 orcinol 与还原糖的反应来量化这些生物表面活性剂，从而得到可以在 421 nm 处通过分光光度法测量的产物，如前所述¹⁸。由于与 orcinol 的反应对鼠李糖不具有特异性，因此使用从不含大量其他含糖分子（如脂多糖 （LPS））的培养上清液中提取的 RL 进行该方法非常重要。这里使用酸化的氯仿/甲醇混合物进行 RL¹⁸ 的液体萃取，但也可以使用乙酸乙酯，固相萃取 （SPE） 产生非常好的结果¹⁹。此处描述的 orcinol 方法不需要复杂的设备，如果在制备分析样品时特别小心，可以提供可靠的结果，如前所述。为确保正确的样品制备，必须包括一个无法产生 RL²⁰ 的铜绿假单胞菌 rhlA 突变体，并为每个测定执行 3 个生物学重复和 3 个技术重复。

文献^16,21 关于用 orcinol 法测定 RL 存在重大争议，一些研究表明 RL 的产生被高估了，并且该测定对鼠李糖缺乏特异性，可能检测其他糖。但是，我们在这里证明，在适当的条件下，所描述的方法可以准确和具体。此外，为了与本文概述的程序进行比较，我们利用 dRL 标准品的 UPLC-MS/MS 检测，并证明使用 orcinol 方法也获得了类似的结果。使用该方法量化 RL 的详细方案包含在补充文件 1 中。

这些方案使用类型菌株 PAO1 （系统群 1）、PA14 （系统群 2） 和 PA7 （系统群 3） 进行示例。选择这些菌株是因为它们具有很好的特征并产生不同的 RL 谱。