Här beskriver vi ett protokoll för att applicera ett enda monolager av grafen på elektronmikroskopirutnät och hur man förbereder dem för användning vid kryoEM-strukturbestämning.
Kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) har visat sig vara en kraftfull teknik för att undersöka atomstrukturen hos makromolekylära komplex. Provberedning för kryoEM kräver att proverna bevaras i ett tunt lager glasaktig is, vanligtvis upphängd i hålen i en fenestrerad stödfilm. Alla vanliga provberedningsmetoder för kryoEM-studier exponerar dock provet för luft-vattengränssnittet, vilket introducerar en stark hydrofob effekt på provet som ofta resulterar i denaturering, aggregering och komplex dissociation. Vidare påverkar föredragna hydrofoba interaktioner mellan regioner i provet och luft-vattengränssnittet de orienteringar som makromolekylerna tar, vilket resulterar i 3D-rekonstruktioner med anisotrop riktningsupplösning.
Adsorption av kryoEM-prover till ett monolager av grafen har visat sig bidra till att mildra interaktioner med luft-vattengränssnittet samtidigt som införandet av bakgrundsbrus minimeras. Grafenbärare erbjuder också fördelen att avsevärt sänka den erforderliga koncentrationen av proteiner som krävs för kryoEM-avbildning. Trots fördelarna med dessa stöd används grafenbelagda rutnät inte i stor utsträckning av kryoEM-gemenskapen på grund av de oöverkomliga kostnaderna för kommersiella alternativ och de utmaningar som är förknippade med storskalig intern produktion. Denna artikel beskriver en effektiv metod för att förbereda batcher av kryoEM-rutnät som har nästan full täckning av monolagergrafen.
Kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) är en alltmer tillämpbar teknik som används för att undersöka 3D-strukturer hos biomakromolekyler. Tekniska framsteg inom elektronmikroskopoptik, direkt elektrondetektion1 och datoralgoritmer 2,3,4 under det senaste decenniet har gjort det möjligt för kryoEM-användare att bestämma strukturerna hos biokemiskt stabila makromolekylära komplex till nära atomär upplösning 5,6,7,8 . Trots dessa framsteg finns det fortfarande anmärkningsvärda hinder för att bevara prover för kryoEM-avbildning, vilket hindrar majoriteten av biologiska prover från att lösas upp till så höga upplösningar.
Provberedning för högupplöst cryoEM-analys innebär att makromolekyler fångas in i ett brett spektrum av orienteringar i ett tunt lager av förglasad is. “Blot and plunge”-metoderna för frysning är de mest använda metoderna som används för att generera tunna filmer av biologiska prover på rutnät för kryoEM-studier 9,10. Dessa metoder innebär att man applicerar några mikroliter provlösning på ett EM-galler som innehåller en fenestrerad film som har gjorts hydrofil och därefter torkar bort större delen av provet med filterpapper innan gallret snabbt sänks ner i en kryogen av flytande etan eller etan-propanblandning9.
Även om denna metod framgångsrikt har använts för att bestämma strukturer för ett brett spektrum av biologiska prover, utsätter alla vanliga kryoEM-provberedningsmetoder prover för det hydrofoba luft-vattengränssnittet (AWI), vilket ofta introducerar problem som begränsar högupplöst strukturbestämning. Det är fastställt att biologiska prover har en hög benägenhet att denaturera när de utsätts för AWI, vilket kan leda till komplex aggregering och demontering11,12,13,14. Dessutom gör hydrofoba fläckar på ytan av biologiska prover att partiklar antar föredragna riktningar i isen12. I många scenarier tvingar en enda hydrofob region av provet alla partiklar att anta en singulär orientering i isen, vilket eliminerar förmågan att generera en tillförlitlig rekonstruktion. Förutom problem med AWI kan prover visa en affinitet för ytan på det fenestrerade filmskiktet, vilket begränsar antalet partiklar suspenderade i isen i hålen15.
Flera metodologiska och tekniska lösningar har utvecklats för att minska dessa problem som uppstår vid interaktioner med AWI eller filmerna16,17. En populär metod är att belägga den fenestrerade filmen i EM-gallren med ett tunt (tiotals nanometer) lager av amorft kol. Denna beläggning ger en kontinuerlig yta över hålen till vilken partiklar kan adsorbera, med fördelen att provet delvis skyddas från interaktioner med AWI15,18,19,20. Det extra kollagret ökar dock mängden bakgrundssignal i de avbildade områdena, vilket introducerar brus som kan äventyra uppnåelig upplösning, särskilt för små (<150 kDa) prover. Under de senaste åren har användningen av grafenoxidflingor (GO) för att producera stödfilmer på kryoEM-rutnät visat sig ha fördelar jämfört med traditionellt amorft kol. GO-flingor produceras genom oxidation av grafitskikt, vilket resulterar i pseudokristallina skikt av monoskiktsgrafit som är hydrofila på grund av deras betydande syrehalt i form av karboxyl-, hydroxyl- och epoxigrupper på ytor och kanter. Kommersiella GO-flingor i vattenhaltiga suspensioner är billiga, och det finns många publicerade metoder för att applicera GO-flingor på EM-nät18,21. Dessa metoder resulterar dock ofta i rutnät som endast delvis är täckta med GO-flingor, samt regioner som innehåller flera lager av GO-flingor. Vidare bidrar GO-flingor med en märkbar bakgrundssignal till kryoEM-bilder som ligger nära den som observerats med tunt amorft kol22,23.
Orörd monolagergrafen, som består av en enda 2D-kristallin uppsättning kolatomer, skiljer sig från GO genom att den inte producerar faskontrast i elektronmikroskopet. Monolagergrafen kan därmed användas för att generera ett osynligt stödskikt för avbildning av biologiska prover. Monolayer-grafen är också starkare än GO och kan appliceras som ett enda monolager på ett EM-rutnät, och de senaste framstegen inom tillverkningen av grafenbelagda EM-rutnät har gjort det möjligt att förbereda högtäckande grafennät med ett lager internt 24,25,26,27,28,29,30. Men trots fördelarna med att använda grafenbelagda rutnät för kryoEM-strukturbestämning används de inte i stor utsträckning på grund av de oöverkomliga kostnaderna för kommersiella alternativ och komplexiteten i den interna produktionen. Här beskriver vi en steg-för-steg-guide för att effektivt producera EM-rutnät täckta med ett monolager av grafen för kryoEM-strukturbestämning av biologiska prover (figur 1). Genom att följa detta detaljerade protokoll kan cryoEM-forskare reproducerbart förbereda dussintals högkvalitativa grafenstödnät på en enda dag. Kvaliteten på de grafenbelagda gallren kan enkelt undersökas med hjälp av ett low-end transmissionselektronmikroskop (TEM) utrustat med ett LaB6-filament.
Bevarandet av biologiska prover i ett tunt lager av glasaktig is är ett kritiskt viktigt steg för högupplöst bestämning av kryoEM-strukturen. Forskare stöter dock ofta på problem som uppstår på grund av interaktioner med AWI, som introducerar föredragen orientering, komplex demontering, denaturering och aggregering. Dessutom kan proverna inte alltid koncentreras tillräckligt för att befolka den tunna isen som är upphängd över hålen i en fenestrerad film. Flera forskargrupper har utvecklat metoder för att belägga EM-rutnät med ett monolager av grafen för att hjälpa till att övervinna några av dessa begränsningar 24,25,26,27,28,29,30, och grafennät har använts med stor framgång. Här ger vi steg-för-steg-instruktioner för att effektivt förbereda partier av grafengaller internt och undersöka kvaliteten på grafengallren med TEM. Vi betonar att särskild försiktighet bör iakttas under några av de kritiska stegen, som vi beskriver nedan.
Grafen har en stark tendens att dra till sig luftburna föroreningar. Därför är det viktigt att se till att alla verktyg som kommer i kontakt med grafen/Cu-arket eller gallren är rena och dammfria under tillverkningsprocessen för grafengaller. Täckglas som används för att överföra grafen kan rengöras genom att skölja med etanol och DI-vatten eller använda en luftdammare. Det rekommenderas också att arbeta under ett dragskåp och alltid hålla grafenark och galler täckta med folie eller en ren glasplatta. Damm eller föroreningar på gallren kan hindra grafen från att fästa ordentligt på EM-gallren. Vid hantering av grafen eller grafenbelagda bärverk är det viktigt att vara elektriskt jordad för att förhindra skador på grafenfilmen på grund av statisk urladdning. Statisk urladdning kan undvikas genom att använda en jordningsrem för handleden, vidröra ett jordat metallföremål varje gång grafen eller grafengaller hanteras och/eller inte bära en handske på handen som håller pincetten24.
Eftersom ett monolager av grafen är mycket tunt (bredden på en kolatom) är det viktigt att stödja grafen med ett organiskt skikt som MMA eller poly-MMA (PMMA) under överföringen av grafen till rutnät. PMMA är det mest använda materialet för grafenöverföring. PMMA har dock en stark affinitet med grafen och kan ofta resultera i polymerkontaminering på grafenfilmen. MMA används i detta protokoll, eftersom det lämnar mindre kvarvarande kontaminering25. Både PMMA och MMA har dock nackdelen att de bildar rynkor och sprickor som kan observeras i vissa delar av grafenfilmen (Figur 3B). Det kan vara svårt att undvika dessa rynkor eftersom de ofta uppstår under grafentillväxt med CVD-metoden31. En metod har nyligen utvecklats för att odla ultraplatt grafen utan rynkor, där kopparfolien ersätts med en Cu(111)/safirskiva som tillväxtsubstrat32.
Baserat på vår erfarenhet är det bättre att köpa grafen/Cu-skivor och stödja grafenet med MMA internt än att köpa polymerbelagda Cu-grafenskivor från tillverkare, som blir spröda efter kopparetsning och är svåra att hantera i efterföljande steg. Spinncoatern vi använde för MMA-beläggning kan byggas billigt med hjälp av delar från en lokal dator/järnaffär, som tidigare beskrivits25.
Under steget med MMA-beläggning är det viktigt att täcka hela grafenytan på Cu-grafenarket med MMA. Efter att Cu har etsats bort kommer MMA-grafen att bli halvgenomskinligt, och områden som saknar MMA-täckning kommer att se ut som tomma hål. För att förhindra MMA-beläggning på kopparsidan är det viktigt att placera en liten bit läskpapper under den under beläggningen så att den suger upp överflödig MMA som spinner ut från CVD-filmen.
Efter etsning och sköljning är MMA/grafenarket redo att överföras till EM-galler med hjälp av ett kommersiellt eller hemmagjort trågsystem med en spruta eller peristaltisk pump för att kontrollera vattennivån. Före överföringssteget är det viktigt att noggrant förskölja gallren i successiva bad av kloroform, aceton och IPA. Bakning av grafenbelagda galler vid 65 °C hjälper till att bevara grafenintegriteten och främjar adsorptionen av grafen till gallren. Slutligen, för att förhindra MMA-kontaminering på gallren, är det viktigt att noggrant ta bort MMA i ett acetonbad och rengöra gallren i IPA. Eventuella otvättade MMA-rester kommer att observeras på EM-galler och minska signal-brusförhållandet i bilderna (Figur 3C). Aceton-IPA-tvättprocessen kan upprepas för att ytterligare rengöra grafenytorna.
För att göra grafengallren hydrofila exponerade vi gallren för UV/ozon. Olika modeller av UV/ozonrenare kan kräva optimering för att tillräckligt syresätta grafenskiktet för kryoEM-provberedning utan att skada grafenet. Oavsett system är det viktigt att använda dessa galler för applicering av kryoEM-prover omedelbart efter UV/ozonbehandling. Alternativa metoder för att göra grafenrutnät hydrofila beskrivs i andra studier33,34.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Xiao för hjälpsamma diskussioner när vi etablerade dessa metoder på Scripps Research. B.B. fick stöd av ett postdoktoralt forskningsstipendium från Hewitt Foundation for Medical Research. W.C. stöds av ett predoktoralt stipendium från National Science Foundation. D.E.P stöds av National Institutes of Health (NIH) anslag NS095892 till G.C.L. Detta projekt stöddes också av NIH-anslag GM142196, GM143805 och S10OD032467 till G.C.L.
70% EtOH | Pharmco (190 pf EtOH) | 241000190CSGL | |
Acetone | Sigma Aldrich | 650501-4L | |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 215589-500g | Hazardous; use extreme caution |
Chloroform | Sigma Aldrich | C2432-1L | |
Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids | PELCO | 16830-45 | |
Computer fan | Amazon (Noctua) | B07CG2PGY6 | |
Cover slip | Bellco Glass | 1203J71 | Standard cover slips |
Crystallizing dish | Pyrex | 3140-100 | |
Electronics duster | Falcon Safety Products | 75-37-6 | |
Falcon Dust-off Air Duster | Staples | N/A | |
Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
Fine tip tweezer | Dumont | 0508-L4-PO | |
Flask | Pyrex | 4980-500 | |
Fork | Supermarket | N/A | |
Glass pasteur pipette | VWR | 14672-608 | |
Graphene/Cu | Graphenea | N/A | CVD monolayer graphene cu |
Grid Coating Trough | Ladd Research Industries | 10840 | Fragile |
Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
Kapton Tape | Amazon (MYJOR) | MY-RZY001 | Polyimide tape |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
Long twzeer | Cole Parmer Essentials | UX-07387-15 | |
Metal grid holder | Ted Pella | 16820-81 | |
MMA(8.5)MMA EL 6 | KAYAKU Advanced Materials | M31006 0500L 1GL | Flammable |
Model 10 Lab Oven | Quincy Lab, Inc. | FO19013 | |
Petri dish | Pyrex | 3610-102 | |
Plasma cleaner (Solarus 950) | Gatan, Inc. | N/A | |
Scissors | Fiskars | 194813-1010 | |
Standard Analog Orbital Shaker | VWR | 89032-088 | |
UltrAuFoil R1.2/1.3 – Au300 | Quantifoil | N/A | Holey gold grids |
Ultraviolet Ozone Cleaning Systems | UVOCS | model T10X10/OES |