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Biologia

Fabbricazione di griglie monostrato rivestite di grafene per microscopia crioelettronica

Published: September 08, 2023
doi:
10.3791/65702
, , ,
1Department of Structural and Computational Biology,Scripps Research

Summary

Qui, descriviamo un protocollo per l’applicazione di un singolo monostrato di grafene alle griglie di microscopia elettronica e come prepararle per l’uso nella determinazione della struttura crioEM.

Abstract

La microscopia elettronica criogenica (cryoEM) è emersa come una potente tecnica per sondare la struttura atomica dei complessi macromolecolari. La preparazione del campione per cryoEM richiede la conservazione dei campioni in un sottile strato di ghiaccio vitreo, tipicamente sospeso all’interno dei fori di una pellicola di supporto fenestrata. Tuttavia, tutti gli approcci di preparazione del campione comunemente utilizzati per gli studi crioEM espongono il campione all’interfaccia aria-acqua, introducendo un forte effetto idrofobico sul campione che spesso si traduce in denaturazione, aggregazione e dissociazione complessa. Inoltre, le interazioni idrofobiche preferite tra le regioni del campione e l’interfaccia aria-acqua hanno un impatto sugli orientamenti adottati dalle macromolecole, dando luogo a ricostruzioni 3D con risoluzione direzionale anisotropa.

È stato dimostrato che l’adsorbimento di campioni crioEM a un monostrato di grafene aiuta a mitigare le interazioni con l’interfaccia aria-acqua, riducendo al minimo l’introduzione del rumore di fondo. I supporti in grafene offrono anche il vantaggio di ridurre sostanzialmente la concentrazione richiesta di proteine necessarie per l’imaging crioEM. Nonostante i vantaggi di questi supporti, le griglie rivestite di grafene non sono ampiamente utilizzate dalla comunità crioEM a causa dei costi proibitivi delle opzioni commerciali e delle sfide associate alla produzione interna su larga scala. Questo documento descrive un metodo efficiente per la preparazione di lotti di griglie crioEM che hanno una copertura quasi completa di grafene monostrato.

Introduction

La microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) è una tecnologia sempre più applicabile utilizzata per studiare le strutture 3D delle biomacromolecole. I progressi tecnologici nell’ottica del microscopio elettronico, nel rilevamento diretto di elettroni1 e negli algoritmi informatici 2,3,4 nell’ultimo decennio hanno permesso agli utenti di cryoEM di determinare le strutture di complessi macromolecolari biochimicamente stabili con una risoluzione quasi atomica 5,6,7,8 . Nonostante questi progressi, permangono notevoli ostacoli alla conservazione dei campioni per l’imaging crioEM, che impediscono alla maggior parte dei campioni biologici di essere risolti a risoluzioni così elevate.

La preparazione del campione per l’analisi crioEM ad alta risoluzione comporta l’intrappolamento di macromolecole distribuite uniformemente in un’ampia gamma di orientamenti all’interno di un sottile strato di ghiaccio vetrificato. I metodi di congelamento “blot and plunge” sono i metodi più utilizzati per generare film sottili di campioni biologici su griglie per studi crioEM 9,10. Questi metodi prevedono l’applicazione di alcuni microlitri di soluzione campione a una griglia EM contenente un film fenestrato che è stato reso idrofilo e successivamente l’eliminazione della maggior parte del campione con carta da filtro prima di immergere rapidamente la griglia in un criogeno di etano liquido o miscela di etano e propano9.

Sebbene questo metodo sia stato utilizzato con successo per determinare le strutture di un’ampia gamma di campioni biologici, tutti i metodi di preparazione dei campioni crioEM comunemente usati espongono i campioni all’interfaccia aria-acqua idrofobica (AWI), che spesso introduce problemi che limitano la determinazione della struttura ad alta risoluzione. È stato stabilito che i campioni biologici hanno un’elevata propensione alla denaturazione se esposti all’AWI, che può portare a complesse aggregazioni e disassemblaggi11,12,13,14. Inoltre, le macchie idrofobiche sulle superfici dei campioni biologici fanno sì che le particelle adottino orientamenti preferenziali nel ghiaccio12. In molti scenari, una singola regione idrofobica del campione costringe tutte le particelle ad adottare un orientamento singolare nel ghiaccio, abolendo così la capacità di generare una ricostruzione affidabile. Oltre ai problemi con l’AWI, i campioni possono dimostrare un’affinità per la superficie dello strato fenestrato di pellicola, limitando il numero di particelle sospese nel ghiaccio all’interno dei fori15.

Diverse soluzioni metodologiche e tecnologiche sono state sviluppate per ridurre questi problemi derivanti dalle interazioni con l’AWI o i film16,17. Un approccio popolare è quello di rivestire il film fenestrato delle griglie EM con un sottile strato (decine di nanometri) di carbonio amorfo. Questo rivestimento fornisce una superficie continua attraverso i fori a cui le particelle possono adsorbirsi, con il vantaggio di schermare parzialmente il campione dalle interazioni con l’AWI15,18,19,20. Tuttavia, lo strato di carbonio aggiuntivo aumenta la quantità di segnale di fondo nelle regioni riprese, introducendo rumore che può compromettere la risoluzione raggiungibile, in particolare per campioni di piccole dimensioni (<150 kDa). Negli ultimi anni, l'uso di scaglie di ossido di grafene (GO) per produrre film di supporto su griglie crioEM ha dimostrato di avere vantaggi rispetto al carbonio amorfo tradizionale. I fiocchi di GO sono prodotti attraverso l'ossidazione di strati di grafite, dando luogo a fogli pseudocristallini di grafite monostrato che sono idrofili a causa del loro notevole contenuto di ossigeno sotto forma di gruppi carbossilici, ossidrilici ed epossidici sulle superfici e sui bordi. I fiocchi di GO commerciali in sospensione acquosa sono poco costosi e ci sono numerosi metodi pubblicati per applicare i fiocchi di GO alle griglie EM18,21. Tuttavia, questi metodi spesso si traducono in griglie che sono solo parzialmente coperte da fiocchi di GO, nonché regioni che contengono più strati di scaglie di GO. Inoltre, i fiocchi di GO contribuiscono con un notevole segnale di fondo alle immagini crioEM che è vicino a quello osservato con il carbonio amorfosottile 22,23.

Il grafene monostrato incontaminato, che consiste in una singola matrice cristallina 2D di atomi di carbonio, si distingue dal GO in quanto non produce contrasto di fase al microscopio elettronico. Il grafene monostrato può quindi essere utilizzato per generare uno strato di supporto invisibile per l’imaging di campioni biologici. Il grafene monostrato è anche più resistente del GO e può essere applicato come singolo monostrato su una griglia EM e i recenti progressi nella fabbricazione di griglie EM rivestite di grafene hanno reso possibile la preparazione interna di griglie di grafene monostrato ad alta copertura 24,25,26,27,28,29,30 . Tuttavia, nonostante i vantaggi dell’utilizzo di griglie rivestite di grafene per la determinazione della struttura crioEM, non sono ampiamente utilizzate a causa dei costi proibitivi delle opzioni commerciali e della complessità della produzione interna. Qui, descriviamo una guida passo passo per produrre efficacemente griglie EM ricoperte da un monostrato di grafene per la determinazione della struttura crioEM di campioni biologici (Figura 1). Seguendo questo protocollo dettagliato, i ricercatori di cryoEM possono preparare in modo riproducibile dozzine di griglie di supporto del grafene di alta qualità in un solo giorno. La qualità delle griglie rivestite di grafene può essere facilmente esaminata utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione (TEM) di fascia bassa dotato di un filamento LaB6.

Protocol

1. Preparazione dei materiali e degli accessori necessari per la fabbricazione delle griglie in grafene NOTA: Il grafene si contamina facilmente, il che riduce l’efficienza del rivestimento in grafene e la qualità delle griglie di grafene; Pertanto, è importante pulire accuratamente tutti i materiali che entrano in contatto con il grafene. La preparazione dei materiali e tutte le fasi devono essere eseguite in una cappa aspirante. Raccogli i materiali necessari che verranno utilizzati per rivestire le griglie con grafene (Figura 2A). Sciacquare più volte la vetreria con acqua deionizzata (DI) per rimuovere polvere, lanugine e residui oleosi. Utilizzare salviette usa e getta per pulire i vetrini coprioggetti con etanolo al 75% e utilizzare uno spolverino ad aria per rimuovere eventuali contaminanti.NOTA: Il blocco di supporto della griglia TEM di bloccaggio utilizzato in questo protocollo può contenere fino a 45 griglie. Per una produzione di grandi lotti di griglie di grafene, è possibile preparare 45 griglie o meno contemporaneamente. Tuttavia, si consiglia di iniziare con una produzione in piccoli lotti (da quattro a sei griglie) fino a quando il metodo non viene stabilito in laboratorio. 2. Preparazione di persolfato di ammonio 0,2 M (APS) in acqua NOTA: Questa soluzione APS viene utilizzata come mordenzante per rimuovere il supporto di rame (Cu) dal foglio di grafene/Cu in una fase successiva. Preparare sempre una soluzione APS fresca. Le soluzioni riutilizzate o vecchie non incideranno il rame in modo efficace e potrebbero lasciare residui di rame sul grafene nelle fasi successive. Sciacquare un pallone da 500 ml con acqua deionizzata (DI), quindi aggiungere 200 ml di acqua deionizzata e cuocere nel microonde utilizzando le impostazioni massime per circa 1 minuto per degassare l’acqua. Aggiungere 9 g di persolfato di ammonio a 200 mL di acqua deionizzata per produrre una soluzione di 0,2 M APS.ATTENZIONE: L’APS è tossico, si consiglia di indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) quando si maneggia l’APS. Smaltire i rifiuti APS in un impianto di smaltimento autorizzato. Agitare la soluzione con una barra di agitazione su un agitatore magnetico mentre si collega il pallone a una fonte di vuoto sotto una cappa aspirante.NOTA: La soluzione APS di degasaggio aiuterà a prevenire la formazione di bolle, che possono ridurre l’efficienza dell’incisione Cu nel passaggio 6. 3. Trasferisci il grafene/rame su un vetrino coprioggetto pulito con un pezzo di carta assorbente NOTA: Utilizziamo una pellicola di grafene a deposizione chimica da vapore (CVD) da 15 x 15 cm su Cu di un fornitore di grafene. I fogli di grafene/Cu monostrato acquistati in commercio devono essere conservati sotto vuoto. Poiché il grafene viene coltivato su entrambi i lati del rame con il metodo CVD, i fornitori di grafene generalmente conducono controlli di qualità e raccomandano il lato migliore per l’uso. Ci riferiamo a questo lato raccomandato del grafene come al lato “superiore” mentre l’altro lato è il lato “posteriore” in questo protocollo. Taglia un pezzo di carta assorbente in una forma rettangolare di circa 20 mm x 40 mm. Questa carta assorbente viene utilizzata come imbottitura per il foglio di grafene/Cu e assorbirà l’eccesso di metacrilato di metile (MMA (8.5) MMA EL6) utilizzato per rivestire il foglio di grafene/Cu; pertanto, assicurati di tagliarlo in una dimensione maggiore del foglio di grafene/Cu da utilizzare. Usa del nastro adesivo in poliimmide per fissare i quattro angoli della carta assorbente alla parte superiore di un vetrino coprioggetto pulito che si adatterà a una spatola fatta in casa.NOTA: Il nastro in poliimmide viene utilizzato perché è sottile e può essere rimosso facilmente, il che facilita la manipolazione. Rimuovere un pezzo del foglio di grafene/Cu dalla conservazione sottovuoto. Utilizzare forbici pulite e prive di polvere per tagliare con cura un quadratino del foglio di Cu-grafene che sarà sufficiente a coprire completamente il numero di griglie da preparare. Per 25 griglie disposte in una serie 5 x 5, ad esempio, tagliare un pezzo di 18 mm x 18 mm. Posiziona il foglio di grafene/Cu sopra la carta assorbente con una pinzetta pulita e asciutta. Assicurati che il lato posteriore del foglio di grafene/Cu sia rivolto verso il basso e fai attenzione a non capovolgere accidentalmente il foglio di grafene/Cu poiché è difficile distinguere il lato superiore dal lato posteriore. Fissare i quattro angoli del foglio di grafene/Cu alla carta assorbente/vetrino coprioggetti, riducendo al minimo la quantità di contatto tra il nastro e il foglio di grafene/Cu, poiché le regioni coperte dal nastro non saranno coperte con MMA nel passaggio successivo.NOTA: Le scariche elettrostatiche possono danneggiare le pellicole di grafene e, pertanto, è consigliabile rimanere con messa a terra elettrica e ridurre al minimo l’accumulo di carica statica quando si maneggiano grafene o griglie di grafene. Ciò può essere ottenuto indossando una cinghia di messa a terra da polso o toccando un oggetto metallico collegato a terra immediatamente prima di maneggiare il grafene o le griglie di grafene. 4. Rivestire il foglio di grafene/Cu a strato singolo con uno strato sottile di MMA (8,5) MMA EL6 (MMA) NOTA: Dopo che il Cu è stato inciso, questo strato di MMA supporterà il monostrato di grafene per consentire la gestione del foglio di grafene nei passaggi futuri. Il rivestimento MMA consente anche la visualizzazione del film di grafene poiché un monostrato di grafene da solo sarebbe trasparente. Posizionare il vetrino coprioggetto con il foglio di grafene/Cu nastrato su una spatola fatta in casa (che può essere assemblata utilizzando una ventola per computer) all’interno di una cappa aspirante (Figura 2B), come descritto in precedenza da Han et al.25. Indossando occhiali protettivi, aggiungere due gocce di MMA utilizzando una pipetta di vetro sul foglio di grafene e iniziare immediatamente a girare alla massima velocità. Durante la centrifuga, aggiungere altre due gocce al centro. Centrifugare per 1 min.NOTA: Assicurarsi che sia stata applicata una quantità sufficiente di MMA per rivestire completamente il grafene. Se non sei sicuro, aggiungi qualche altra goccia. Se il grafene non è completamente rivestito, dopo che il Cu è stato inciso, compaiono dei “buchi” nella pellicola. Lasciare asciugare all’aria per 10 minuti all’interno di una cappa aspirante. 5. Rimuovere il grafene sul lato posteriore del foglio di grafene/Cu NOTA: Il grafene cresciuto sul lato posteriore del rame (il lato non rivestito con MMA) deve essere rimosso prima di procedere ai passaggi successivi perché questo grafene in eccesso ridurrà l’efficacia dell’incisione Cu. Rimuoviamo questo grafene esponendo il grafene al plasma, che può essere ottenuto utilizzando qualsiasi dispositivo di scarica di bagliore tipicamente utilizzato per preparare le griglie EM per la preparazione dei campioni biologici. Rimuovere con cautela il nastro e sollevare il foglio di grafene/Cu rivestito in MMA dal vetrino coprioggetti con una pinzetta pulita e asciutta. Fissare con nastro adesivo il pezzo del foglio MMA/grafene/Cu con il lato MMA rivolto verso il basso su un vetrino coprioggetti pulito e privo di polvere. Posizionare il vetrino coprioggetto con il foglio MMA/grafene/Cu nel dispositivo di scarica a incandescenza e applicare le impostazioni che in genere vengono utilizzate durante la preparazione delle griglie per la colorazione negativa o la preparazione del campione crioEM.NOTA: La scarica prolungata di bagliore deve essere evitata per prevenire l’ossidazione del Cu sul lato posteriore, che può causare la contaminazione delle particelle (nano)di ossido di rame (CuO) sulla pellicola di grafene. 6. Incidere il Cu dal foglio MMA/grafene/Cu in soluzione APS In una cappa aspirante, versare 200 ml della soluzione APS appena preparata in un piatto di cristallizzazione pulito e privo di polvere (150 x 75 mm). Rimuovere il foglio MMA/grafene/Cu dal vetrino. Tieni traccia di quale lato contiene l’MMA. Per iniziare l’incisione, posizionare il foglio MMA/grafene/Cu con il lato in Cu trattato al plasma rivolto verso il basso sulla superficie della soluzione APS. Coprire l’ampio bicchiere di vetro con un foglio di alluminio o un coperchio per evitare che la polvere penetri. Incubare per 3 ore. Se la maggior parte del Cu non viene incisa dopo 1 ora, ripetere i passaggi nelle sezioni 2-6 e quindi continuare con il passaggio successivo.NOTA: Se la maggior parte del Cu non viene incisa dopo 1 ora, è probabile che il lato MMA/grafene del film sia stato posizionato sulla superficie della soluzione APS invece che sul lato Cu. Il Cu deve essere mordenzato completamente dopo 3 ore e la pellicola MMA/grafene è incolore se il Cu è mordenzato completamente. Il grafene contamina facilmente, quindi assicurati di coprire tutti i contenitori per evitare l’accumulo di lanugine o residui grassi sulle superfici, poiché ciò avrà un impatto negativo sulla qualità del grafene. 7. Sciacquare la pellicola MMA/grafene in acqua deionizzata In una cappa aspirante, riempire un piatto di cristallizzazione pulito e privo di polvere con acqua deionizzata. Raccogliere delicatamente la pellicola di grafene-MMA con un vetrino coprioggetti pulito e privo di polvere, posizionato con un angolo di ~45° rispetto alla superficie della soluzione APS. Posizionare il vetrino con un angolo di quasi 90° rispetto all’acqua e abbassare delicatamente il vetrino coprioggetti in vetro nell’acqua in modo che l’MMA/grafene scivoli lentamente dal vetrino e galleggi sulla superficie dell’acqua. Lasciare la pellicola MMA/grafene sulla superficie dell’acqua per 1 ora per lavare via l’APS. 8. Pulire le griglie da rivestire con un monostrato di grafene NOTA: Le griglie in cui verrà trasferito il grafene devono essere il più pulite possibile per massimizzare l’adesione del grafene alla superficie della lamina della griglia. Le griglie acquistate in commercio contengono spesso contaminanti residui che devono essere rimossi prima del trasferimento del grafene. Pulire e asciugare tre piatti di cristallizzazione in modo che siano privi di polvere. In una cappa aspirante, versare 200 ml di cloroformio, acetone e alcol isopropilico (IPA) in ciascuno dei tre piatti di cristallizzazione. Coprire i piatti di cristallizzazione con un foglio di alluminio per ridurre al minimo l’evaporazione dei solventi organici.ATTENZIONE: Il cloroformio e l’acetone causano irritazione cutanea e possono essere tossici se inalati. Limitare l’esposizione a questi solventi organici e indossare DPI. Posizionare la base del blocco di supporto della griglia TEM di serraggio sul fondo del primo piatto di cristallizzazione contenente 200 mL di cloroformio. Trasferire ogni griglia singolarmente dalla scatola della griglia a un pozzetto nel blocco di supporto della griglia, assicurandosi che il lato della pellicola fenestrato sia rivolto verso l’alto. Coprire il piatto di cristallizzazione con un foglio di alluminio, posizionarlo su uno shaker orbitale e agitare delicatamente per 30 minuti. Posizionare il coperchio metallico sul blocco portagriglia, che fisserà le griglie durante il trasferimento al prossimo piatto di cristallizzazione. Sollevare con cautela il blocco porta griglia dal piatto di cristallizzazione con una forchetta piegata e una pinzetta lunga e posizionarlo sul fondo del secondo piatto di cristallizzazione contenente 200 ml di acetone. Rimuovere il coperchio dal blocco portagriglia e agitare delicatamente su uno scuotitore orbitale per 30 minuti. Posizionare il coperchio sul blocco portagriglia e trasferire in un piatto di cristallizzazione contenente 200 ml di soluzione IPA per rimuovere i residui di acetone. Rimuovere il coperchio dal blocco portagriglia e agitare delicatamente per 20 minuti. Trasferire singolarmente le griglie con il lato della pellicola fenestrato rivolto verso l’alto dal blocco portagriglia a una capsula di Petri di vetro ricoperta di carta assorbente. Asciugare le griglie per almeno 30 minuti sotto la cappa aspirante, assicurandosi che le griglie siano coperte per evitare che la polvere vi cada sopra. 9. Trasferire le griglie pulite su carta assorbente posta su una rete metallica in acciaio inossidabile o su un vassoio forato sotto l’acqua deionizzata NOTA: Le griglie devono essere immerse sotto l’acqua deionizzata su una superficie piana in modo che il grafene possa galleggiare sull’acqua e abbassarsi sulle griglie. Questo può essere eseguito utilizzando una depressione di rivestimento della griglia commerciale o con una capsula di Petri e una pompa peristaltica, come quella utilizzata per generare griglie di ossido di grafene, come descritto da Palovcak et al.18. Posizionare la rete o il vassoio in acciaio inossidabile in una vasca di rivestimento a griglia e risciacquare con acqua deionizzata. Tagliare la carta assorbente leggermente più piccola della rete/vassoio in acciaio inossidabile e posizionarla sopra la piattaforma, immersa nell’acqua deionizzata.NOTA: La carta assorbente è leggermente più piccola della piattaforma per consentire lo spostamento e la movimentazione. Trasferire delicatamente le griglie pulite con il lato della pellicola fenestrato rivolto verso l’alto sopra la carta assorbente. Le griglie saranno probabilmente idrofobiche, quindi immergi le griglie nell’acqua verticalmente o potrebbero piegarsi a causa della tensione dell’acqua. Posizionare le griglie in una serie quadrata in modo che siano il più vicine possibile l’una all’altra, ma non sovrapposte (Figura 2C). Le griglie sono ora pronte per essere rivestite con un monostrato di grafene. Riempire la vasca di rivestimento della griglia con altra acqua deionizzata in modo che la superficie dell’acqua sia almeno 5 mm sopra le griglie. 10. Trasferisci il grafene alle griglie Estrarre con cautela il film MMA/grafene dal piatto di cristallizzazione con un vetrino coprioggetti pulito abbassando lentamente il vetrino coprioggetti nel trogolo ad angolo, a una certa distanza dal film di grafene. Posizionare il vetrino coprioggetto sotto il foglio di grafene-MMA in modo che i bordi del foglio e del vetrino coprioggetto siano paralleli, quindi sollevare il vetrino coprioggetto verticalmente fuori dall’acqua, portando con sé il film MMA/grafene. Trasferire il film MMA/grafene nella vasca abbassando il vetrino coprioggetto nell’acqua con un angolo di ~45°, in modo che il film MMA/grafene si stacchi dal vetrino coprioggetto e galleggi sulla superficie dell’acqua. Posizionare il film MMA/grafene direttamente sopra le griglie prima che il livello dell’acqua si abbassi. Utilizzare una pipetta Pasteur in vetro la cui punta è stata fusa per sigillare l’apertura per manipolare attentamente la posizione della pellicola MMA/grafene. Abbassare lentamente il livello dell’acqua con la siringa, a circa 1,25 ml/min in modo che il film MMA/grafene copra completamente le superfici della griglia mentre atterra sulla carta da filtroNOTA: Potrebbe essere necessaria un’ulteriore manipolazione del foglio di grafene-MMA per mantenere la sua posizione sopra le griglie quando il livello dell’acqua scende. Usa un paio di pinzette pulite e asciutte per sollevare la carta assorbente che tiene le griglie su una capsula di Petri pulita, asciutta e priva di polvere, oppure trasferisci l’intera piattaforma in acciaio inossidabile. Asciugare all’aria le griglie MMA/grafene per almeno 30 minuti sotto la cappa aspirante. Tenere le griglie coperte con un foglio di alluminio o un coperchio per evitare qualsiasi contaminazione da particelle di polvere. Trasferire le griglie in un’incubatrice e cuocerle in un’incubatrice a 65 °C per 30 min. Rimuovere le griglie dall’incubatrice e lasciarle coperte per 5 minuti a temperatura ambiente per raffreddare le griglie a temperatura ambiente. 11. Rimozione MMA e pulizia delle griglie NOTA: L’MMA deve essere accuratamente lavato via con acetone per evitare che l’MMA residuo sulle griglie rivestite di grafene. In una cappa aspirante, preparare due piastre di cristallizzazione contenenti 200 ml di acetone e una capsula di cristallizzazione contenente 200 ml di isopropanolo (IPA) a temperatura ambiente. Coprire i piatti di cristallizzazione con un foglio di alluminio per ridurre al minimo l’evaporazione dei solventi organici.ATTENZIONE: Indossare i DPI quando si maneggia l’acetone in quanto può causare irritazioni cutanee e può essere dannoso se inalato. Posizionare la base del blocco di supporto della griglia TEM di serraggio sul fondo del primo piatto di cristallizzazione contenente 200 ml di acetone fresco. Trasferisci ogni griglia individualmente dalla carta assorbente a un pozzetto nel blocco porta griglia, assicurandoti che il lato MMA sia rivolto verso l’alto. Coprire il piatto di cristallizzazione con un foglio, posizionarlo su uno shaker orbitale e agitare delicatamente per 30 minuti. Posizionare il coperchio metallico sul blocco portagriglia, che fisserà le griglie durante il trasferimento al prossimo piatto di cristallizzazione. Sollevare con cautela il blocco porta griglia dal piatto di cristallizzazione con una forchetta piegata e una pinzetta lunga e posizionarlo sul fondo del secondo piatto di cristallizzazione contenente 200 ml di acetone fresco. Rimuovere il coperchio dal blocco portagriglia e agitare delicatamente su uno scuotitore orbitale per 30 minuti. Posizionare il coperchio sul blocco portagriglia e trasferire nel piatto di cristallizzazione contenente 200 ml di soluzione IPA per rimuovere i residui di acetone. Rimuovere il coperchio dal blocco portagriglia e agitare delicatamente per 20 minuti. Trasferire le griglie in una piccola capsula di Petri di vetro ricoperta di carta assorbente e asciugare all’aria le griglie per almeno 10 minuti. Tenere le griglie coperte con un coperchio per evitare qualsiasi contaminazione da particelle di polvere. Le griglie sono pronte per essere utilizzate o trasferite in una scatola a griglia avvolta con un foglio di alluminio all’interno di un essiccatore sottovuoto.NOTA: La conservazione delle griglie di grafene all’interno di un essiccatore sottovuoto può prevenire la contaminazione di particelle idrofobiche dalle condizioni ambientali. Queste griglie possono essere conservate fino a diversi mesi prima dell’uso27. 12. Rendere idrofile le griglie di grafene con trattamento UV/Ozono NOTA: Il grafene è estremamente idrofobo, il che non è compatibile con la preparazione del campione cryoEM, poiché gli approcci blot-plunge richiedono una superficie idrofila su cui una goccia di campione può diffondersi in modo uniforme. Mentre i tradizionali dispositivi a scarica luminosa possono essere configurati per pulsare delicatamente il plasma per rendere idrofila la superficie del grafene, questi dispositivi tendono a distruggere il sottile monostrato di grafene. In precedenza è stato dimostrato che un detergente UV/ozono può essere utilizzato per ossigenare parzialmente la superficie del grafene25, rendendolo idrofilo per la preparazione del campione crioEM senza danneggiare il monostrato. Se si utilizza un sistema UV/Ozono che richiede l’adescamento, accendere il sistema e adescare la lampada per 10 minuti (a questo punto, assicurarsi che nessuna griglia sia esposta). Mentre il pulitore UV/ozono è in fase di adescamento, rimuovere le griglie dall’essiccatore sottovuoto e trasferirle su un vetrino coprioggetti pulito. Quando il sistema UV/ozono è pronto, posizionare il vetrino coprioggetti contenente le griglie con il lato del grafene rivolto verso l’alto nel detergente UV/ozono ed esporre le griglie al gas ozono per 4 minuti. Dopo l’esposizione all’ozono, utilizzare immediatamente le griglie per la preparazione del campione crioEM.NOTA: Se si utilizza un sistema UV/Ozono che richiede l’adescamento, le griglie devono essere posizionate nel pulitore immediatamente dopo che la lampada è stata adescata per 10 minuti, altrimenti sarà troppo fredda per produrre una quantità sufficiente di gas ozono per ossigenare il grafene per la preparazione del campione. Non esporre le griglie al gas ozono per più di 6 minuti, poiché distruggerà lo strato di grafene.

Representative Results

L’esecuzione corretta del protocollo di fabbricazione della griglia di grafene qui descritto si tradurrà in griglie EM completamente rivestite con un singolo monostrato di grafene. La copertura di grafene delle griglie può essere verificata utilizzando qualsiasi TEM. Poiché un monostrato di grafene pulito è quasi invisibile nel TEM, è necessario esaminarlo utilizzando la modalità di diffrazione del microscopio e osservare i punti di Bragg corrispondenti all’organizzazione esagonale degli atomi di carbonio che compongono il grafene (Figura 3A). È normale osservare occasionalmente alcune rughe di grafene monostrato, che vengono introdotte durante il rivestimento MMA (Figura 3B). Si può anche controllare il livello di contaminazione presente sul grafene acquisendo un’immagine ad alto ingrandimento al centro di uno dei fori ricoperti di grafene (Figura 3C). Se acquisita con un rivelatore ad alta risoluzione, una trasformata di Fourier di questa immagine dovrebbe contenere macchie di Bragg corrispondenti alla spaziatura carbonio-carbonio a 2,14 Å (Figura 4C). Un monostrato di atomi di carbonio non produce una diffusione di elettroni sufficiente a generare un contrasto di fase, e quindi un’immagine di grafene pulito non presenterà anelli Thon associati alla funzione di trasferimento del contrasto in una trasformata di Fourier dell’immagine. Tuttavia, è molto difficile prevenire la contaminazione delle griglie di grafene dopo che sono state prodotte, e un lavaggio insufficiente delle griglie EM o la rimozione di MMA dopo il rivestimento di grafene si tradurrà in notevoli contaminanti sulle griglie che sono visibili nelle immagini dello spazio reale (Figura 3C). Come mostrato nella Figura 4, le griglie di grafene hanno un effetto concentrante su un campione, come si osserva quando si confrontano 0,5 mg/mL di apoferritina applicati a griglie d’oro bucate con (Figura 4A) e senza il supporto di grafene (Figura 4B). Protocolli di fabbricazione del grafene simili sono stati precedentemente descritti per risolvere le strutture crioEM di proteine come l’apoferritina ad alta risoluzione25,27. Figura 1: Schema per la preparazione di griglie crioEM rivestite di grafene. Vengono illustrati i passaggi chiave del processo di fabbricazione della griglia in grafene. Abbreviazioni: cryoEM = microscopia elettronica criogenica; MMA = metacrilato di metile; APS = persolfato di ammonio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Materiali necessari per la realizzazione di griglie di grafene. (A) I materiali necessari per il rivestimento delle griglie crio-EM sono etichettati di conseguenza. (B) Vista ravvicinata della verniciatrice con foglio di grafene/Cu fissato su una carta assorbente su un vetrino. La spatolatrice può essere assemblata acquistando parti da un negozio di computer/ferramenta locale. (C) Vista ravvicinata della depressione di rivestimento della griglia collegata a una siringa che può essere utilizzata per controllare il livello dell’acqua. Le griglie sono posizionate sopra una carta assorbente su una rete di acciaio inossidabile. La carta assorbente aiuta a manovrare la posizione delle griglie in modo che il foglio di grafene possa essere abbinato ad esso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Un’immagine rappresentativa del modello di diffrazione e immagini in campo chiaro di una griglia di grafene che mostra rughe o contaminazione da MMA . (A) Le griglie EM ricoperte da un monostrato di grafene mostreranno picchi di Bragg corrispondenti al reticolo esagonale del grafene quando vengono ripresi in un TEM in modalità di diffrazione. Il picco di Bragg corrispondente alla spaziatura carbonio-carbonio di 2,14 Å è cerchiato e indicato con una freccia. (B) Un’immagine in campo chiaro di una griglia di grafene monostrato con alcune rughe (indicate con una freccia) nel monostrato di grafene. (C) Un’immagine in campo chiaro di grafene monostrato con contaminazione da MMA (indicata con una freccia). Barre di scala = 100 nm (B,C). Abbreviazioni: EM = microscopia elettronica; MMA = metacrilato di metile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Apoferritina su griglie d’oro ricoperte di grafene: (A) Micrografia CryoEM di 0,5 mg/mL di apoferritina su griglie d’oro ricoperte di grafene. (B) L’apoferritina fotografata alla stessa concentrazione è visibile a una concentrazione sostanzialmente inferiore quando viene preparata utilizzando griglie d’oro bucate senza grafene. (C) FFT della micrografia crioEM di 0,5 mg/mL di apoferritina su griglie d’oro ricoperte di grafene, con i picchi di Bragg corrispondenti al reticolo esagonale di grafene indicato. Barre della scala = 100 nm (A,B). Abbreviazioni: cryoEM = microscopia elettronica criogenica; FFT = trasformata di Fourier veloce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

La conservazione di campioni biologici in un sottile strato di ghiaccio vitreo è un passaggio di fondamentale importanza per la determinazione della struttura crioEM ad alta risoluzione. Tuttavia, i ricercatori incontrano spesso problemi derivanti dalle interazioni con l’AWI, che introduce l’orientamento preferenziale, il disassemblaggio complesso, la denaturazione e l’aggregazione. Inoltre, i campioni non possono sempre essere concentrati a sufficienza per popolare il sottile ghiaccio sospeso attraverso i fori di una pellicola fenestrata. Diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato metodi per rivestire le griglie EM con un monostrato di grafene per aiutare a superare alcune di queste limitazioni 24,25,26,27,28,29,30 e le griglie di grafene sono state utilizzate con grande successo. Qui, forniamo istruzioni dettagliate per preparare efficacemente lotti di griglie di grafene internamente ed esaminare la qualità delle griglie di grafene mediante TEM. Sottolineiamo che è necessario prestare particolare attenzione durante alcuni dei passaggi critici, che descriviamo di seguito.

Il grafene ha una forte tendenza ad attirare i contaminanti presenti nell’aria. Pertanto, durante il processo di fabbricazione della griglia di grafene, è importante assicurarsi che tutti gli strumenti che entrano in contatto con il foglio di grafene/Cu o le griglie siano puliti e privi di polvere. I vetrini coprioggetto utilizzati per trasferire il grafene possono essere puliti risciacquando con etanolo e acqua deionizzata o utilizzando uno spolverino ad aria. Si consiglia inoltre di lavorare sotto una cappa aspirante e di tenere sempre i fogli e le griglie di grafene coperti con un foglio di alluminio o una lastra di vetro pulita. Polvere o contaminanti sulle griglie possono impedire al grafene di aderire completamente alle griglie EM. Quando si maneggiano griglie rivestite di grafene o grafene, è importante essere collegati a terra elettricamente per evitare danni al film di grafene dovuti a scariche elettrostatiche. Le scariche elettrostatiche possono essere evitate utilizzando una cinghia di messa a terra da polso, toccando un oggetto metallico collegato a terra ogni volta che si maneggiano grafene o griglie di grafene e/o non indossando un guanto sulla mano che tiene le pinzette24.

Poiché un monostrato di grafene è molto sottile (la larghezza di un atomo di carbonio), è importante supportare il grafene con uno strato organico come MMA o poli-MMA (PMMA) durante il trasferimento del grafene alle griglie. Il PMMA è il materiale più utilizzato per il trasferimento del grafene. Tuttavia, il PMMA ha una forte affinità con il grafene e spesso può provocare la contaminazione del polimero sul film di grafene. L’MMA viene utilizzato in questo protocollo, in quanto lascia meno contaminazione residua25. Tuttavia, sia il PMMA che l’MMA hanno lo svantaggio di formare rughe e crepe che possono essere osservate in alcune aree del film di grafene (Figura 3B). Può essere difficile evitare queste rughe poiché si verificano comunemente durante la crescita del grafene con il metodo CVD31. Recentemente è stato sviluppato un metodo per la coltivazione di grafene ultrapiatto senza rughe, in cui la lamina di rame viene sostituita da un wafer di Cu(111)/zaffiro come substrato di crescita32.

Sulla base della nostra esperienza, è meglio acquistare fogli di grafene/Cu e supportare il grafene con MMA internamente piuttosto che acquistare fogli di rame ricoperti di polimeri dai produttori, che diventano fragili dopo l’incisione su rame e sono difficili da maneggiare nelle fasi successive. Lo spin coater che abbiamo usato per il rivestimento MMA può essere costruito a basso costo utilizzando parti di un negozio di computer/ferramenta locale, come descritto in precedenza25.

Durante la fase del rivestimento MMA, è importante coprire l’intera superficie del grafene sul foglio di grafene Cu con MMA. Dopo che il Cu è stato inciso, il grafene MMA diventerà semitrasparente e le aree prive di copertura MMA appariranno come fori vuoti. Per evitare il rivestimento MMA sul lato del rame, è importante posizionare un piccolo pezzo di carta assorbente sotto di esso durante il rivestimento in modo che assorba l’MMA in eccesso che fuoriesce dalla pellicola CVD.

Dopo l’incisione e il risciacquo, il foglio MMA/grafene è pronto per essere trasferito alle griglie EM utilizzando un sistema di abbeveratoio commerciale o fatto in casa con una siringa o una pompa peristaltica per controllare il livello dell’acqua. Prima della fase di trasferimento, è importante presciacquare accuratamente le griglie in bagni successivi di cloroformio, acetone e alcool isopropilico. La cottura di griglie rivestite di grafene a 65 °C aiuta a preservare l’integrità del grafene e promuove l’adsorbimento del grafene alle griglie. Infine, per prevenire la contaminazione da MMA sulle griglie, è importante rimuovere accuratamente l’MMA in un bagno di acetone e pulire le griglie in alcool isopropilico. Eventuali residui di MMA non lavati saranno osservati sulle griglie EM e diminuiranno il rapporto segnale/rumore delle immagini (Figura 3C). Il processo di lavaggio acetone-IPA può essere ripetuto per pulire ulteriormente le superfici in grafene.

Per rendere idrofile le griglie di grafene, abbiamo esposto le griglie ai raggi UV/ozono. Diversi modelli di detergenti UV/ozono possono richiedere un’ottimizzazione per ossigenare sufficientemente lo strato di grafene per la preparazione del campione crioEM senza danneggiare il grafene. Indipendentemente dal sistema, è fondamentale utilizzare queste griglie per l’applicazione di campioni crioEM subito dopo il trattamento UV/Ozono. Metodi alternativi per rendere idrofile le griglie di grafene sono descritti in altri studi33,34.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Xiao Fan per le utili discussioni durante la definizione di questi metodi presso Scripps Research. B.B. è stato sostenuto da una borsa di ricerca post-dottorato della Hewitt Foundation for Medical Research. W.C. è supportato da una borsa di studio pre-dottorato della National Science Foundation. Il D.E.P. è supportato dalla sovvenzione del National Institutes of Health (NIH) NS095892 a G.C.L. Questo progetto è stato sostenuto anche dalle sovvenzioni NIH GM142196, GM143805 e S10OD032467 a G.C.L.

Materials

70% EtOH Pharmco (190 pf EtOH) 241000190CSGL
Acetone Sigma Aldrich 650501-4L
Ammonium persulfate (APS) Sigma Aldrich 215589-500g Hazardous; use extreme caution
Chloroform Sigma Aldrich C2432-1L
Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids PELCO 16830-45
Computer fan Amazon (Noctua) B07CG2PGY6
Cover slip Bellco Glass 1203J71 Standard cover slips
Crystallizing dish Pyrex 3140-100
Electronics duster Falcon Safety Products 75-37-6
Falcon Dust-off Air Duster Staples N/A
Filter papers Whatman 1001-055
Fine tip tweezer Dumont 0508-L4-PO
Flask Pyrex 4980-500
Fork Supermarket N/A
Glass pasteur pipette VWR 14672-608
Graphene/Cu Graphenea N/A CVD monolayer graphene cu
Grid Coating Trough Ladd Research Industries 10840 Fragile
Isopropanol Fisher Scientific 67-63-0
Kapton Tape Amazon (MYJOR) MY-RZY001 Polyimide tape
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Long twzeer Cole Parmer Essentials UX-07387-15
Metal grid holder Ted Pella 16820-81
MMA(8.5)MMA EL 6 KAYAKU Advanced Materials M31006 0500L 1GL Flammable
Model 10 Lab Oven Quincy Lab, Inc. FO19013
Petri dish Pyrex 3610-102
Plasma cleaner (Solarus 950) Gatan, Inc. N/A
Scissors Fiskars 194813-1010
Standard Analog Orbital Shaker VWR 89032-088
UltrAuFoil R1.2/1.3 – Au300 Quantifoil N/A Holey gold grids
Ultraviolet Ozone Cleaning Systems UVOCS model T10X10/OES
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Referências

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Cryoelectron MicroscopyGrapheneMonolayerSample PreparationAir-water InterfaceHydrophobic EffectDenaturationAggregationComplex DissociationPreferred OrientationBackground NoiseProtein Concentration

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Basanta, B., Chen, W., Pride, D. E., Lander, G. C. Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy. J. Vis. Exp. (199), e65702, doi:10.3791/65702 (2023).
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